钩端螺旋体病实验室诊断研究进展

李彬，叶强，徐颖华

·综述·

钩端螺旋体病实验室诊断研究进展

李彬，叶强，徐颖华

102629 北京，中国食品药品检定研究院国家卫生健康委员会生物技术产品检定方法及其标准化重点实验室

钩端螺旋体（简称钩体）病是一种由不同血清群致病性钩体所引起的急性感染性疾病，属自然疫源性疾病[1]。大多数哺乳动物均可为致病性钩体的携带宿主，钩体通过动物尿液排出后可以在水或土壤中存活数月，成为重要的传染源[2]。尽管钩体病发病率总体呈现下降趋势，但是随着全球气候变暖、洪水灾害频发，钩体病疫情在全球范围内仍时有发生，尤其是对发展中和不发达国家造成较大威胁[3-4]，我国近年也有死亡病例报道[5]。人们对此类传染病放松警惕以及非特异性临床症状表现等因素导致诊断难度加大，存在着钩体病暴发或大流行的潜在危险[6]。

近些年，随着生物信息学、基因组学等领域飞速发展，围绕钩体病的研究在不断地深入和拓展，钩体病的实验室诊断方法也在不断创新。因此，本文结合最新的文献资料就目前国内外钩体病的实验室诊断方法研究进展进行梳理，期望对钩体病的快速诊断和预防提供借鉴作用。

1 传统的钩体培养法

在钩体病发病初期，未使用抗生素类药物前，可以从病人血液或脑脊液采取样本进行培养，通过在暗视野显微镜中观察有无钩体生长进行诊断。钩体的培养最常使用 Korthof 或EMJH（Ellinghausen McCullough Johnson Harris）作为主要的选择性培养基[7]，并在培养基加入 8% ～ 10% 的兔血清、辅以少量抑菌剂提高样本培养阳性率。该诊断方法需要在生物安全柜中进行操作，且钩体培养生长至少需要2 周的时间，极易延误治疗时机，因此在实际临床中应用较少[4, 8]。

虽然通过传统的培养法来诊断钩体病实际应用很少，但是通过分离培养获得钩体菌株是一项最为基础的工作，可以全面了解钩体的分布，有效推动菌株标准化和疫苗研制[6]。

2 血清学诊断方法

血清学诊断主要是测定人或动物血清中的钩体特异性抗体，主要包括显微镜凝集试验（microscopic agglutination test，MAT）和酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA），目前市场已有商业化基于 IgG 和 IgM 抗体的 ELISA 检测试剂盒或商用快速诊断测试卡[4, 9]。

2.1 MAT

MAT 是通过使用 7 天龄左右不同血清型钩体培养物与患者不同稀释度的血清相互作用，然后在暗视野显微镜下观察凝集现象，以视野中 50%钩体被凝集的患者血清最高稀释度作为终点凝集滴度；其诊断标准是终点凝集滴度≥ 1:400 或二次采血双份血清终点凝集滴度呈 4 倍或以上增长者为阳性[4, 10]。

然而，由于 MAT 方法要求实验室保有不同血清型钩体，且需要定期传代培养维持钩体菌株以制备活抗原，不易标准化，对实验室及操作人员要求比较高[11]；此外，在疾病早期阶段钩体抗体水平低，易成假阴性诊断，而在钩体病疫区因部分人口的 MAT 滴度升高，易成假阳性诊断；无法区分感染时间、不能用于流行病学和感染监测[4]。例如，2018 年在广州发现的 1 例钩体病例采用 MAT 检测结果为阴性，从而延误了治疗时机[5]。

2.2 ELISA

用于钩体病诊断的 ELISA 主要有间接法（包括 IgM-ELISA 和 IgG-ELISA）、凝胶扩散 ELISA（Dig-ELISA）和斑点 ELISA（Dot-ELISA）。ELISA 法可以从不同血清型感染病人血清中检测特异性 IgM 或 IgG 来诊断钩体病，其中大多数 IgM 靶向抗体主要在疾病的第一周内产生，且在第二周确诊最为准确，可对急性和亚急性感染进行诊断[3]。ELISA 因易于操作且不需要活抗原而发展成常用工具，目前市场上有许多商用的 IgM-ELISA 法检测试剂盒[3-4]。

为了提高结果的质量，研究人员对 IgM-ELISA 技术诊断钩体病进行了改进。Niloofa 等[12]通过用辣根过氧化酶与 IgM/IgG 偶联并加入碳酸盐缓冲液和磷酸盐缓冲液对聚乙烯微孔板进行处理，结果显示这种血清特异性的in house-ELISAs 方法可用于钩体病的实验室诊断；此外，有人利用基因特异性抗原改进 ELISA 法，建立了多种属特异性检测方法，包括 rGroEL1-524 IgM-ELISA 检测方法[13]和以 lipL32 重组蛋白作为抗原的 in house-间接 ELISA 法[14]，这些方法进一步提高了 ELISA 诊断的敏感性、特异性和可靠性。

3 分子诊断方法

随着分子生物技术的发展，新的技术可以实现钩体感染的快速检测，且具有更高的灵敏度和特异性。目前，多种分子生物学技术和方法被用于钩体实验室诊断。

3.1 PCR

在钩体病感染的早期和康复阶段，可通过对样本（培养物或患者体液）进行钩体的特异性基因靶向扩增，进行快速和直接的诊断。钩体中管家基因（、、s）或特异性基因（32、、、1）已被用作于 PCR 诊断靶标基因[15]，其中32基因是一种毒力因子，仅在致病性钩体中发现，因此常被用作靶标基因以提高检测的特异性[16]。基于32 基因特异性引物和 TaqMan 探针，采用荧光定量 PCR（RT-PCR）检测钩体病血清学阳性患者尿液样本中的钩体，表现出高特异性、敏感性、不易被污染等特点[16]。大量研究表明，基于32基因的 RT-PCR 特异性高达 99%，甚至达 100%。在发病的前 10天使用，获得结果可靠，可作为钩体病早期诊断的重要工具[17-18]。

研究人员通过将多重 PCR、MAT、ELISA 联合使用，最大程度降低误诊率，极大提高了诊断的灵敏度[19]。但以 PCR 为基础的分子诊断方法也有一定的局限性，比如不能确定所感染钩体的血清型。

3.2 环介导等温扩增检测方法

环介导等温扩增（loop mediated isothermal amplification，LAMP）是通过针对目的基因的 6 个不同区域设计两对引物、在单一温度下 1 h 左右完成目的基因检测的方法。由于 LAMP 方法无需贵重精细仪器，已广泛应用于临床诊断，尤其在一些发展中国家[20]应用较多。基于 LAMP 开发的钩体病实验室诊断检测方法日益增多，并已从简单的浊度视觉结果观察扩展到纸基核酸检测或与生物传感器装置配套使用[20-21]。

Varsha 等[22]研制了一种基于 Whatman 滤纸作为检测基质的 LAMP 方法，将在基质中包含有（用作阳性对照）、非致病性钩体21、致病性钩体32、阴性对照、人球蛋白基因（用作阳性对照）5 个靶点基因与中间样本槽（待检测感染血样）相通，进行 LAMP 扩增，后加入 DNA 染料，可用智能手机和图像处理软件进行分析。可在 15 min 之内完成扩增，检测灵敏度低至 50 ag/μl 的病原体，可区分血清样本中的致病性和非致病性钩体。Nurul Najian 等[21]开发了多重环介导等温扩增（m-LAMP），可同时监测目标 DNA 模板和 LAMP 对照，用于致病性钩体的检测，该方法检测灵敏度低至每毫升 0.395 基因组。该研究团队又于 2019年将 LAMP 与一种生物传感器进行集成，利用 DNA 杂交系统进行分析，通过颜色快速判定结果，检测灵敏度低至 200 fg/μl，且对 172 株钩体菌株的检测特异性为 100%[20]。

其中，Structurei，t表示旅游产业结构升级，Convergi，t表示文化与旅游产业融合；Mediatori，t表示中介变量，包括文化与旅游消费需求(Demandi，t)、技术创新(Techi，t)、文化与旅游业协同集聚(Clusteri，t)；Controlsi，t表示控制变量，包括市场化水平(Marketi，t)、人力资本(Labori，t)、政府支出(Governi，t)、贸易开放(Openi，t)；α、β、γ、φ为系数向量，εi，t为随机误差项。

多项研究表明，LAMP 用于临床样本的钩体病实验室诊断具有良好的特异性、敏感性和准确性，成本较低[23]，适用于不同层级医院对疑似钩体病例进行实验室诊断。

3.3 基于生物传感器的其他分子诊断方法

生物传感器是将生物识别元件与换能器相结合的装置，将生物信号转换为可测量的读数，从而确认生物相互作用，比如酶-底物反应、抗原-抗体反应、DNA-DNA 相互作用、DNA-蛋白质相互作用等，可以提供一种快速、简单且经济高效的、基于芯片实验室的微生物检测方法[8]。

目前，已有多种基于生物传感器检测钩体的探索研究[24]。Nagraik 等[25]基于32基因开发了一种电化学 DNA 传感器，该生物传感器的多壁碳纳米管经 AuNPs 修饰，固定标记的 ssDNA 探针，展现出对靶标微生物高度的敏感性和特异性。此外，研究人员应用金纳米颗粒-碳纳米纤维复合制备而成的电极，采用循环伏安法和电化学阻抗法进行电化学分析，可 30 min 之内完成致病性钩体特异性22 基因的检测[26]。

上述生物传感器无法区分致病性钩体血清型，针对该问题，Bothammal 等[27]于 2022 年首次报道了基于检测钩体外膜脂多糖（LPS）电化学生物传感器，将十二烷硫醇通过共价键结合在金电极上，形成自组装单层膜结构并固定 LPS，与待检血清样本中钩体抗体结合，实现钩体感染的快速诊断。

总体而言，生物传感器在疾病诊断领域显示出巨大的潜力，但仍需进一步解决生物传感器诊断钩体病可重复性和设备成本等问题[8]。

3.4 宏基因组二代测序技术

宏基因组二代测序（metagenomic next-generation sequencing，mNGS）技术指采用二代测序技术对特定标本中所有核酸序列进行测序[28]。mNGS 因对样本中所有核酸序列进行无偏倚测序，在病原体检测方面有检测新发未知病原体、罕见病原体、跨物种传播病原体等优势[28]。

钩体病典型特征为黄疸、肾功能衰竭和出血性并发症等，当出现罕见表现，如严重的肺泡出血、社区获得性肺炎或其他病原体检测均呈阴性的病例时，极容易误诊。因此mNGS 对帮助识别不明原因感染的病例具有重要价值[29-30]。2014 年，Wilson 等[31]对一名患有严重联合免疫缺陷的 14 岁男孩采用 mNGS 进行病原体检测，是文献记载的最早采用 mNGS 技术对钩体病进行诊断的病例。该病例出现持续发热、头疼，继而出现脑积水、癫痫症状，在 4 个月内 3 次就诊，采用脑组织活检进行 38 项病原学检测，均未发现病原体，最终采用 mNGS 技术诊断为钩体脑膜炎。我国近几年也有不少 mNGS 技术用于钩体实验室诊断的报道。研究人员对一名流感试验阳性患者样品进行 mNGS 检测分析，结果提示钩体感染。病人随后接受常规青霉素治疗和机械呼吸支持，最终获得治愈[30]；谭锦花等[5]对一名因初诊为多器官功能障碍综合征、流行性出血热待排且MAT 显示钩体病阴性的患者采用 mNGS 检测，发现钩体基因序列，但因确诊时间晚，患者第二天死亡；此外，还有多例在细菌培养、MAT、血清学分析、PCR 扩增等方法检测病原体阴性的情况下，采用 mNGS 对患者样品进行分析，发现钩体且对症治疗后好转的研究报道[32-33]。

上述结果表明，mNGS 作为一种新的诊断方法，可更早、更精确地发现常规检查所不能发现的病原体，尤其是针对传统的培养法生长缓慢的病原体[34]，这有助于临床上尽早使用有针对性的药物进行治疗。

mNGS 的分析是基于 DNA 文库构建所获得的高质量测序数据与微生物基因组数据库比对进行判定，因此，完善和获得不同血清群致病型钩体的全基因组信息数据是 mNGS 发挥作用的物质基础。从 2003 年我国科学家完成第一株致病性钩体测序工作以来[35]，国内外研究人员对上千株钩体基因组进行了研究，尤其是对致病性钩体基因组的研究，这些研究促进了对该病原菌遗传多样性、分子进化和致病机制的认识，形成了海量钩体基因组信息，这些数据信息的共享将助力全世界临床实验室对钩体的快速准确诊断[36-38]。

4 结语

在长期研究过程中建立与发展起来的钩体病实验室诊断方法中，尽管传统的钩体分离培养和 MAT 法的灵敏度和检出率低，但仍需通过培养方法获得不同来源的钩体分离菌株，为后续钩体遗传多样性、分子进化和致病机制、疫苗研制等工作提供物质基础；以 PCR 为基础的各种分子检测方法是钩体病实验室诊断技术中灵敏度和特异性均较好的检测方法。在临床实践中，操作人员需通过严格规范操作，避免假阳性、假阴性结果的出现。而 LAMP 检测方法无需贵重仪器，操作简单、检测所需时间短且特异性高，尤其适合于基层或偏远地区实验室。

基于微型电化学传感器芯片（生物传感器）的分子诊断方法灵敏、快速，但现在仍处于临床验证阶段。另外，mNGS 分析成本较高，还面临诊断标准、实验流程与分析流程的标准化以及不同国家公共卫生监管等问题。

生命科学的发展，为致病性钩体基因组和蛋白质组学研究提供了强大而丰富的手段，为了解钩体病的分子机制、推动开发新的诊断治疗方法提供了新的机遇。未来钩体诊断技术的发展应注重诊断方法的准确性、灵敏度和稳定性，实现装置的便携化，提高检测设备的检测速度和通量。

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10.3969/j.issn.1673-713X.2022.05.006

国家科技重大专项（2018ZX10102-001）；国家自然科学基金（81471968）

叶强，Email：qiangyee@nifdc.org.cn；徐颖华，Email：xuyh@nifdc.org.cn

2022-01-27