基于免疫组织化学方法分析YWHAZ在非小细胞肺癌的表达及临床意义

王小文，程晓菊，李廷超，田 敏，刘代顺

(1.遵义医科大学第三附属医院 急诊科，贵州 遵义 563000；2.遵义医科大学第三附属医院 中心实验室，贵州 遵义 563000；3.遵义医科大学第三附属医院 病理科，贵州 遵义 563000；4.遵义医科大学 珠海校区，广东 珠海 519041)

在我国，肺癌在恶性肿瘤中的发病率和死亡率均为第一位，发病率为81.6/1万，死亡率为71.5/1万，且呈现逐年增高的趋势[1]。非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer，NSCLC)以80%的高占比成为了肺癌的主要类型[2]。迄今，肺癌的主要治疗策略有手术切除、放疗、化疗以及免疫治疗[3-4]，尽管近年来其主要治疗方式在不断改进，肺癌患者的5年生存率有所上升，但仍然仅为18%[5]。由于在肿瘤的发生发展进程中，存在分子信号通路的多样性[2,6]，成为了目前癌症治疗的难点及瓶颈，因此，对肺癌演变过程中的核心枢纽分子的鉴定，以实施精准分子靶向治疗改善肺癌患者预后具有十分重要的临床价值。

酪氨酸3单加氧酶/色氨酸5单加氧酶激活蛋白zeta(也称YWHAZ或14-3-3ζ)，属于14-3-3蛋白家族，位于人类8号染色体上，由YWHAZ miRNA编码的一种蛋白质，大小28～30 kDa，是肿瘤发展进程中参与调控多条分子信号通路的核心蛋白[7]。研究表明，YWHAZ是许多信号转导途径的中枢蛋白，与细胞凋亡、细胞周期、细胞增殖、粘附和自噬等相关蛋白相互作用[8]。

本实验采用免疫组织化学的方法，首先在多种癌症类型中检测YWHAZ的表达水平，然后重点在非小细胞肺癌及其癌旁组织中检测YWHAZ的表达水平。我们还分析了非小细胞肺癌中YWHAZ的表达水平与患者临床病理特征的关联。本研究旨在提高YWHAZ在非小细胞肺癌的诊断、治疗和预后评估中的临床价值。

1 材料与方法

1.1 临床标本 收集2018年1月至2020年8月遵义医科大学第三附属医院收治后经手术切除的137例多种类型癌症组织。其中非小细胞肺癌38例，均经过病理学检查确诊为NSCLC。在38例非小细胞肺癌中，男18例，女20例；肺腺癌31例，肺鳞癌7例；年龄43～86岁，中位年龄59.5岁；临床分期：Ⅰ～Ⅱ期19例，Ⅲ～Ⅳ期19例；有明确淋巴结或远处转移17例，病理学活检对所有转移淋巴结及转移灶的肿瘤细胞来源进行判断。所有标本在收集前其患者暂未接受放疗及化疗。本研究通过遵义医科大学第三附属医院伦理委员会审批，编号：伦审(2020)-70号。

1.2 临床组织芯片 所使用的组织芯片购自武汉爱威尔生物科技有限责任公司，芯片编号为LAC1402，点直径为1.5mm，该芯片包含35例非小细胞肺癌组织和35例配对的癌旁肺组织，以及患者的临床病理资料，包括患者年龄、性别、分化程度、肿瘤大小、TNM分期等。

1.3 免疫组织化学染色试剂 兔抗人YWHAZ抗体购自武汉三鹰生物技术有限公司；山羊抗兔IgG、10%正常羊血清、苏木精、抗原修复液及显色试剂均购自上海基因科技有限公司；3%过氧化氢、无水乙醇、二甲苯均购自南昌雨露公司；磷酸缓冲盐溶液(PBS)按说明书自行配制。

1.4 免疫组织化学 二甲苯对组织切片脱蜡、过梯度酒精后PBS洗涤，内源性过氧化物酶被3%过氧化氢封闭，抗原修复液在高温及高压条件下修复抗原3 min，自然冷却至室温，用10%正常羊血清室温进行封闭，半小时后用YWHAZ抗体在室温孵育3 h，PBS洗涤3次，用山羊抗兔IgG在37 ℃恒温箱中孵育0.5 h，PBS洗涤3次，用 DAB显色剂进行显示处理，复染用苏木精，再经梯度酒精脱水、二甲苯透明，用中性树脂进行封片，在显微镜下观察染色结果。YWHAZ的染色评估，采用Image-Pro Puls软件对染色效果统计评分，根据细胞的染色范围(<5%为0分；6%～25%为1分；26%～50%为2分；51%～75%为3分；>75%为4分)和染色的强度(阴性为0分；弱阳性为1分；中等阳性为2分；强阳性为3分)评分，最终分数为染色范围分数乘以染色强度分数。病例被分为低表达组(0～6分)和高表达组(6分以上)。

1.5 统计学分析 采用SPSS 18.0软件进行统计分析,组间差异比较采用χ2检验,P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 YWHAZ在多种肿瘤中的表达 为了评估YWHAZ在肿瘤中的表达情况，本研究对137例多种癌症类型的临床标本进行了免疫组织化学染色。结果显示，YWHAZ在每种癌症中均有表达，主要表达于细胞质与细胞膜(见图1)。我们分析了其总体阳性表达率达到94.2%(129/137)，其中，肺癌的阳性表达率高达96.4%(27/28),甲状腺癌阳性表达率为100%(28/28)，乳腺癌阳性表达率为100%(18/18)，胃癌阳性表达率为100%(6/6)，结、直肠癌阳性表达率为92.8%(13/14)，肝癌阳性表达率为100%(3/3)，泌尿系统癌阳性表达率为100%(4/4)，女性生殖系统癌阳性表达率为87.5%(14/16)，淋巴瘤阳性表达率为66.7%(6/9)，其他类型癌阳性表达率为90.9%(10/11)，见表1、图1。

表1 YWHAZ在多种类型癌症中的表达率

2.2 YWHAZ在非小细胞肺癌组织和癌旁肺组织中的表达 将收集的73例非小细胞肺癌组织标本(38例术中标本及35例组织芯片标本)和36例癌旁肺组织标本，其中肺腺癌50例，肺鳞癌23例，用免疫组织化学方法检测了其中YWHAZ的表达。结果显示，YWHAZ主要表达于非小细胞肺癌的细胞质及细胞膜，呈状棕黄色或棕褐色区，与癌旁肺组织相比，在肺腺癌组织及肺鳞癌组织中都观察到YWHAZ的表达水平增加(见图2)。在肺腺癌组织中，YWHAZ高表达率54%(27/50)，在肺鳞癌组织中，YWHAZ高表达率78.2%(18/23)，在癌旁肺组织中高表达率16.7%(6/36)，肺腺癌和肺鳞癌的高表达率均高于癌旁肺组织(P<0.001，见表2)。

表2 YWHAZ在非小细胞肺癌及其癌旁组织中的表达

A:肺鳞癌癌旁组织；B:肺腺癌癌旁组织；C:肺鳞癌低表达；D:肺腺癌低表达；E:肺鳞癌高表达；F:肺腺癌高表达；×400。

2.3 YWHAZ的表达与非小细胞肺癌临床病理特征之间的差异 为了评价YWHAZ在非小细胞肺癌病例中的临床意义，将73例非小细胞肺癌组织中YWHAZ的高低表达与患者的临床病理特征之间的差异采用χ2检验分析(见表3)。73例非小细胞肺癌患者，肿瘤长径的中位数为4 cm。本实验观察到YWHAZ的高表达与患者的肿瘤大小(P=0.001)、临床分期(P<0.001)以及转移(P<0.001)之间的差异有显著性，与患者的年龄、性别、吸烟史均无显著差异(P>0.05)。

3 讨论

2021年全球高发病率的癌症中，包含了结直肠癌、肺癌、淋巴瘤、甲状腺癌、膀胱癌、肾癌、宫颈癌、肝癌、乳腺癌[9]。目前对高发癌症类型的靶向基因研究是当下肿瘤研究的热点。本研究收集的137例临床组织标本包含了这十类高发癌症类型，通过免疫组织化学染色分析，我们发现，YWHAZ在多种癌症中均呈阳性表达，且平均阳性表达率高达94.2%。已有研究表明，YWHAZ的表达水平在肝细胞癌、结直肠癌、乳腺癌、肺癌等多种癌症中均显著上调，参与肿瘤细胞的多种细胞活动[10-13]，我们的研究结果与上述研究一致，提示把YWHAZ作为人类癌症诊断的靶点分子可能具有潜在临床意义。我们还发现，无论是在男性或女性中都高发的肺癌，YWHAZ的阳性染色率高达96.4%，高于94.2%的平均水平,表明YWHAZ在肺癌中可能更具研究价值。

YWHAZ已被证明在多种癌症中经常被上调并通过调节癌症中的多种信号通路发挥致癌基因的作用[7]。在肺癌中，有研究发现，与30个非肺癌组织相比，在152个NSCLC组织中，YWHAZ的mRNA和蛋白表达均显著升高[14]。YWHAZ在高侵袭性肺癌细胞株中的mRNA和蛋白表达均高于低侵袭性肺癌细胞株[15]。此外，YWHAZ在肺癌的发展进程中可能参与了上皮间质转化过程[16]。在我们的研究中，通过免疫组织化学方法分析发现，非小细胞肺癌组织中YWHAZ的阳性表达水平明显高于癌旁肺组织，与先前研究结果一致，已有的研究结果表明YWHAZ可能是非小细胞肺癌发生发展中关键的核心枢纽分子。另外，在分别对癌旁肺组织、肺腺癌和肺鳞癌中YWHAZ高低表达量的统计中，肺腺癌与肺鳞癌的YWHAZ表达显著高于癌旁肺组织。

细胞的增殖失控、抗凋亡和转移被认为是肿瘤的恶性生物学行为，是影响患者预后的重要因素。已有研究发现，YWHAZ的过表达可增强肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力[13]。在另一项研究中，YWHAZ通过结合 Par3 可促进肺腺癌细胞生长、迁移和转移[17]。在乳腺癌中，YWHAZ敲除可诱导MCF-37细胞的凋亡[18]。这些研究表明，YWHAZ在肿瘤中起着促进肿瘤细胞发挥恶性生物学行为的重要作用。本实验的73例非小细胞肺癌病例中，肿瘤直径≥4cm患者的YWHAZ高表达率显著高于肿瘤直径<4cm的患者，肿瘤临床分期为晚期患者的YWHAZ高表达率显著高于肿瘤临床分期为早期的患者，发生转移患者的YWHAZ高表达率显著高于未发生转移的患者。提示YWHAZ的高表达增强了非小细胞肺癌细胞的增殖、抗凋亡以及转移能力。

本实验结果提示，YWHAZ的表达增加可能普遍存在于多种肿瘤的发生过程中。YWHAZ在肺腺癌及肺鳞癌的发生发展过程中可能发挥重要作用，可为肺腺癌及肺鳞癌的临床靶向治疗提供新的思路。