骨髓间充质干细胞对K562 细胞衰老的作用及Raf/ MEK/ ERK 信号通路的影响

周 雯 周 玥 唐紫云 何思悦 刘小虎 毕子莹 李敏瑞 杨 楠

大理大学组织学与胚胎学教研室，云南大理 671000

慢性髓系白血病是一种未成熟髓细胞在体内大量扩增的增生性疾病。酪氨酸激酶抑制剂作为一线治疗，提高了患者的生存率[1-3]，但耐药、不良反应及高成本，使其应用受到限制[4-6]。骨髓微环境是造血干细胞生长发育的主要场所，与白血病的发生有着密切的联系[7-10]。骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）作为微环境中的基质细胞对白血病的进展起到了一定的调控作用[11-12]。K562 细胞与间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）进行直接或间接共培养后，其增殖均受到抑制，但间接培养中的抗增殖作用较弱，表明细胞间直接接触的重要性[13]。诱导肿瘤细胞衰老是肿瘤治疗的新策略[14-17]，可以为患者提供等效或更长的生存期。但目前报道的BMSCs通过诱导K562 细胞衰老而抑制白血病进展的研究少见，本研究主要探究BMSCs 能否诱导K562 衰老及其可能的机制，为白血病的治疗提供理论和实验基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物

6～8 周SPF 级C57BL/6J 雄性小鼠30 只，体重20～30 g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，合格证号为430727210100922464，许可证号为SCXK（湘）2019-0004，本实验由大理大学动物伦理委员会批准（2020-028）。实验动物饲养环境温度为22～25℃，湿度45%～55%，提供充足的水和饲料，饲养1 周后进行实验。

1.2 主要试剂及器材

DMEM/F12 培养基（Gibco 公司，8120254）；成脂、成骨分化诱导培养基（Cyagen 公司，MUBMX-90031、MUBMX-90021）；SA-β-Gal 衰老染色试剂盒（碧云天生物技术有限公司，C0602）；流式细胞仪（Beckman，美国Cyto-FLEX）。CD29、CD44、CD45（Bioscience 公司，美国SC3746、SC7297、SC1178）；CDKN2A/p16INK4a、β-actin、HRP 标记山羊抗兔IgG（abcam，英国，EPR1473、ab210083、ab97051）；GAPDH、兔抗人多克隆抗体p-Raf、p-MEK、p-ERK（Santacruze，美国，sc-47724、sc-135707、sc-101733、sc-101760）。K562 细胞购自齐氏生物科技有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 BMSCs 的培养和鉴定 取小鼠双下肢骨髓细胞，使用DMED/F12 完全培养基重悬细胞，转入6 cm 塑料培养皿中，置于37℃，5%CO2培养箱中培养。取第3 代BMSCs 的细胞悬液，采用流式细胞术检测BMSCs表面抗原CD29、CD244、CD45 的表达。使用成脂、成骨分化诱导液诱导后，采用油红O、茜素红染色鉴定BMSCs 的分化能力。

1.3.2 CCK-8 法检测细胞增殖情况 取第3 代BMSCs，将0、0.25×105、0.5×105、1×105、2×105个BMSCs 分别铺入3 个24 孔板，每个浓度设置3 个复孔，置于37℃，5%CO2培养箱中培养12 h，贴壁后每孔加入1×105个K562 细胞悬液500 μl，即BMSCs 与K562细胞的比例为1∶4、1∶2、1∶1、2∶1，未添加BMSCs 的K562 细胞作为对照。于24、48、72 h 收集细胞铺入96 孔板中，每孔100 μl，检测450 nm 处吸光度值并计算K562 细胞增殖率。选择K562 细胞增殖率最低时的共培养时间及细胞比例作为BMSCs 组，常规培养的K562 细胞作为对照组进行后续实验。

1.3.3 SA-β-Gal 染色法检测细胞衰老情况 两组细胞进行衰老染色，显微镜下观察并计算400 个细胞中的衰老阳性细胞率。本实验重复3 次。

1.3.4 Western blot 检测p16INK4a、p-Raf、p-MEK、p-ERK 蛋白的表达量 收集两组细胞提取并测定总蛋白浓度，电泳、转膜、封闭后，加入兔抗鼠CDKN2A/p16INK4a（1∶1 000）、内参一抗β-actin（1∶1 000）。p-Raf（1∶5 000）、p-MEK（1∶20 000）、p-ERK（1∶10 000）和内参一抗GAPDH（1∶1 000）4℃过夜，TBST 缓冲液漂洗2 次，加入二抗HRP 标记山羊抗兔IgG（1∶1 000），室温反应2 h，凝胶成像系统曝光。本实验重复3 次。

1.4 统计学方法

采用SPSS 26.0 对所得数据进行统计学分析。计量资料采用均数±标准差（）表示，比较采用t 检验。以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 BMSCs 表面标志物的鉴定

BMSCs 表面标志物CD29、CD44、CD45 的阳性表达率分别为89.18%、87.65%、1.16%。见图1。

图1 骨髓间充质干细胞表面标志物

2.2 BMSCs 的成脂、成骨分化

BMSCs 油红O 染色可见红色脂滴，茜素红染色可见橘红色钙结节。见图2。

图2 骨髓间充质干细胞成脂、成骨分化染色

2.3 不同比例BMSCs 与K562 细胞共培养不同时间的K562 细胞增殖率比较

BMSCs∶K562 细胞比例为1∶2、1∶1、2∶1 时，共培养各时间点的K562 细胞增殖率均低于同一时间点对照组，比例为2∶1 时各时间点的K562 细胞增殖率均低于同一时间点1∶2、1∶1（P ＜0.05）。BMSCs∶K562细胞比例为2∶1 时，共培养48 h 后K562 细胞增殖率均低于共培养24、72 h后（P ＜0.05）。见图3。

图3 BMSCs 对K562 细胞增殖能力的影响（n=3）

2.4 两组细胞衰老情况比较

BMSCs 组衰老细胞阳性率高于对照组（P ＜0.01）。见图4。

图4 BMSCs 对K562 细胞衰老的影响（n=3）

2.5 两组p16INK4a 蛋白表达水平比较

BMSCs 组p16INK4a蛋白表达水平高于对照组（P ＜0.01）。见图5。

图5 两组p16INK4a 蛋白表达水平比较（n=3）

2.6 两组p-Raf、p-MEK、p-ERK 蛋白表达水平比较

BMSCs 组p-Raf、p-MEK、p-ERK 蛋白表达水平均低于对照组（P ＜0.01）。见图6。

图6 两组p-Raf、p-MEK、p-ERK 蛋白表达水平比较（n=3）

3 讨论

BMSCs 是具有自我更新和多向分化能力的非造血祖细胞，是为成纤维细胞样贴壁生长的细胞群体。在本研究分离的BMSCs 中，干细胞表面标志物CD29、CD44 阳性表达，造血干细胞表面标志物CD45 阴性表达，且其在体外成功分化为脂肪细胞和骨细胞，提示分离成功。

既往研究报道，脐带MSCs 能抑制白血病细胞增殖并增强伊马替尼诱导的K562 细胞凋亡[18-19]。健康小鼠BMSCs 注入白血病小鼠的骨髓中后，改善了局部骨髓微环境，改善血小板生成，减少了肿瘤负荷，并延长了白血病小鼠的生存期[20]。细胞增殖能力降低和SA-β-Gal 活性增高是衰老的常见表现。本研究中，BMSCs 与K562 细胞共培养后，K562 增殖率降低，SA-β-Gal 活性增高，提示BMSCs 能够诱导K562 细胞衰老。p16INK4a是一种衰老调控分子，其高表达推动细胞进入衰老[21]。本研究中，BMSCs 组p16INK4a高于对照组，提示其能促进K562 细胞衰老。

Raf/MEK/ERK 信号级联在细胞增殖、细胞周期等过程中发挥重要作用[22]。此信号通路在白血病BCRABL 融合基因形成后被异常激活[23-24]，导致K562 细胞大量增殖，靶向此通路的抑制剂能够增强白血病化疗效果[25]。本研究中，BMSCs 组Raf、MEK、ERK 活化蛋白表达量降低，提示BMSCs 发挥的抗衰老作用或许与该通路相关。目前与BMSCs 诱导肿瘤细胞衰老的报道较少，诱导肿瘤细胞衰老或许能减少肿瘤的复发，提供更长的生存期。现有研究停留在细胞阶段，缺乏相关的体内实验进行佐证，后续需深入研究BMSCs诱导肿瘤衰老的机制及影响，为临床应用提供切实可靠的依据。