海藻酸盐基胃黏膜保护胶的理化性能研究

王涵 何牧野 曾行,2 杨敏一 孟珠 杨柳 王春仁

0 引言

胃癌作为胃黏膜上皮病变引起的恶性肿瘤，是严重威胁人类健康的疾病之一。根据国际癌症研究中心(International Agency for Research on Cancer,IARC)发表的研究结果：2018年全球胃癌新发病例约103万例，排在全球恶性肿瘤第6位[1]；死亡病例约78万例，排在全球恶性肿瘤第2位[2]。在我国，胃癌的防控形势更为严峻。我国胃癌的发病率目前在所有恶性肿瘤中占第2位，死亡率高居第3位，我国每年胃癌约占全球胃癌新发病例的一半，居全球首位[3-4]。内窥镜下胃黏膜切除手术(endoscopic mucosal resection,EMR)和胃黏膜剥离术(endoscopic submucosal dissection,ESD)是早期胃癌和胃良性肿瘤切除的微创手术，不仅可达到根治早期胃癌的目的，且具有创伤小、对患者生存质量影响小等优点，已逐渐取代部分传统外科手术。但是采用这两种方式，尤其是ESD术后产生的胃溃疡较普通溃疡更大更深，术后易出血及穿孔，裸露的创面在胃酸和胃蛋白酶的作用下，愈合时间也较长，容易形成疤痕组织[5-8]，如何在ESD术后快速修复胃黏膜也是临床关注的热点。

海藻酸盐是由(1-4)-β-交联的D-甘露糖醛酸和(1-4)-α-交联的古洛糖醛酸组成的长链聚合物，是最具代表性的海洋多糖材料。它作为一种天然的生物材料，具有良好的生物相容性，已广泛用作皮肤烧伤涂敷料、医用黏合剂、组织工程支架等[12-14]。在消化系统领域，海藻酸钠溶液被用作治疗胃溃疡消化道出血的止血剂，0.6%的海藻酸钠稀释液也被注射用于ESD手术中的黏膜抬举[15]。但是到目前为止，海藻酸盐基凝胶剂型还从未被用作ESD术后胃黏膜创面的修复及再生材料。

本研究中新型的海藻酸盐基胃黏膜保护胶包括胶体液及固定液两部分。其中，胶体液以海藻酸盐为主要成分，添加多聚赖氨酸及葡聚糖；固定液为水溶性钙溶液。该保护胶通过胃窥镜喷涂后两种组分可在生理条件下形成固体凝胶膜，作为胃黏膜的保护胶覆盖到胃黏膜表面。作为在胃这一特殊环境下使用的医疗器械，胃黏膜保护胶需要适用于胃的酸性环境，在酸性条件依旧能保持其形态完整且力学强度满足要求，因此本研究将对该材料进行在同一pH值不同固化时间和不同pH值同一时间固化后的最大拉伸力测试，通过其力学性能的变化反映其所成的胶体的强度；通过抗酶解性能、组织黏附力、酸屏障实验对其耐胃蛋白酶消化能力、对胃黏膜组织的黏附力及对胃酸的抵御能力进行考察；并通过触变性能实验考察其通过胃窥镜直接喷涂的可能性。该研究将为这一产品的临床使用提供参考。

1 研究方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料

胃黏膜保护胶(杭州英健生物科技有限公司，中国)；新鲜猪胃(河北奥博牧业有限公司，中国)。

1.1.2 试剂

盐酸(国药集团化学试剂有限公司，中国)；无水乙醇(国药集团化学试剂有限公司，中国)；胃蛋白酶(北京酷来搏科技有限公司，中国)；生理盐水(恒宁医疗器械有限公司，中国)；DMEM培养基(Corning，美国)。

1.2 仪器

干燥箱(GRX-9023A，上海一恒科学仪器有限公司，中国)；电子天平(XSE205DU，梅特勒-托利多集团，瑞士)；恒温培养箱[ZHWY-103B，赛默飞世尔科技(中国)有限公司，美国]；紫外分光光度计(U-3310，日立，日本)；蠕动泵(BT100-1L，保定兰格恒流泵有限公司，中国)；旋转黏度计(VT-550，德国哈克公司，德国)；万能材料试验机(3382，ITW 集团英斯特朗公司，美国)；pH计(FE28-standard，梅特勒-托利多集团，瑞士)。

1.3 实验方法及步骤

1.3.1 酸敏感性实验

(1) 不同pH值盐酸溶液固定同一时间最大拉伸力。将9 mL胶体液倒入直径9 cm的无菌培养皿中，加入固定液10 mL固化2～3 min成膜，倒掉固化液；再加入pH为1.0、2.0、3.0、4.0的盐酸溶液10 mL继续固化30 min，倒掉多余液体，将样品裁成2 cm×2 cm片材，不同pH值条件下取5片片材采用万能材料试验机测定片材断裂时的拉伸力。

(2) pH=1.0盐酸溶液固定不同时间最大拉伸力。参照(1)的方法用固定液固化胶体成膜，再加入pH为1.0的盐酸溶液10 mL分别固化15 min、30 min、60 min、120 min和180 min。将样品裁成2 cm×2 cm片材，每个时间点取5片片材测定膜断裂时的拉伸力。

1.3.2 抗酶降解实验

参照中国药典方法[9]，准备含胃蛋白酶及不含胃蛋白酶的人工胃液。将在pH为1.2的盐酸溶液中固化30 min的胶体膜制成直径为16 mm的圆片样品。37℃在上述溶液中分别浸泡5片测试样品，每隔两天换液。分别测定3 d、1周、2周时材料的剩余质量百分比，计算降解率。以SPSS 21.0软件进行统计学分析。若两组样本方差齐性且符合正态分布，选择两独立样本t检验；若方差不齐选用两样本秩和检验。P<0.05表示两组间差异有统计学意义；P>0.05表示两组间差异无统计学意义。

1.3.3 组织黏附力实验

取市售新鲜猪胃[10]置37 ℃生理盐水中切开并将胃内壁清洗干净，清洗的胃在2 h内使用。剪取5 cm×5 cm面积的胃组织，固定于聚乙烯薄膜上，切除胃的黏膜层形成1 cm×1 cm的创面。将0.5 mL胃黏膜保护胶胶体液均匀涂布于胃黏膜创面及附近正常黏膜上，然后喷洒固定液，5 min后用15 mL生理盐水冲洗掉多余的固定液。胃组织在恒温培养箱(相对湿度92.5%，温度37℃)中放置20 min后固定于角度为60°的冲洗斜槽上，调节蠕动泵流速为20 mL/min，用0.1 mol/L盐酸冲洗5 min，冲洗液收集于已知质量的蒸发皿中；另取相同面积的胃组织同法操作并收集冲洗液。在70 ℃烘干，称重。组织黏附力用黏附百分率表示，平行测试8个样品。计算方法如下:

胃组织黏附百分率(%) ={[M-(G-g-m)]/

M}×100%

式中：M为胃黏膜保护胶的质量；g为空蒸发皿质量；G为蒸发皿与烘干后残渣总质量；m为同体积冲洗液所含固体物质的质量(空白对照)。

1.3.4 触变性能实验

在旋转黏度计中加入40 mL的样品或对照品并在50 r/min和200 r/min 转速下的黏度进行计算。假塑比值=高转速下的黏度/低转速下的黏度。其中样品组为胃黏膜保护胶，对照组为2%的羧甲基纤维素。

1.3.5 酸屏障作用实验

配制浓度为37.0%、18.5%、9.3%、4.6%的盐酸溶液。如图1所示，在24孔板中加入1 mL无血清培养基；样品组的Transwell小室中加入0.2 mL的胃黏膜保护胶，对照组不做处理，然后每组中加入25 μL不同浓度的盐酸溶液，每组做3个复孔，用pH计测量培养基的pH值变化。

图1 酸屏障作用实验示意图Figure 1 Schematic diagram of acid barrier test

2 结果

2.1 酸敏感性实验

不同pH值(pH=1.0、2.0、3.0、4.0)条件下固定30 min，pH值为1.0时最大拉伸力最大，随pH值的升高拉伸力呈现下降趋势，结果见表1；当pH=1.0时，随着固定时间延长，胶体膜的最大拉伸力升高，力学性能改善，结果见表2。

表1 不同pH值盐酸溶液固定同一时间最大拉伸力变化(n=5)Table 1 The maximum tensile force of HCl solutions fixed at different pH values changes at the same time(n=5)

表2 pH 为1.0的盐酸溶液固定不同时间最大拉伸力变化(n=5)Table 2 The maximum tensile force of HCl solution with pH 1.0 fixed at different time(n=5)

2.2 抗酶降解实验

以SPSS 21.0软件进行统计学分析，两组样本方差齐性且符合正态分布，选择两独立样本t检验。3 d、1周、2周时两组间的降解率无统计学意义(P>0.05)。说明该胃黏膜保护胶具有抗酶解性能，结果见表3。

表3 抗酶降解实验结果(n=5)Table 3 Results of anti-enzyme degradation test(n=5)

2.3 组织黏附力实验

胃黏膜保护胶的黏附率在90%以上，具有较好的组织黏附性，结果见表4。

表4 组织黏附率实验结果(n=8)Table 4 Results of tissue adhesion rate test(n=8)

2.4 触变性能实验

胃黏膜保护胶在50 r/min的黏度为0.98 Pa·s；在200 r/min的黏度为0.38 Pa·s，假塑比值为0.39；2%羧甲基纤维素在50 r/min及200 r/min的黏度分别为0.41 Pa·s及0.24 Pa·s；假塑比值为0.58。因此，胃黏膜保护胶假塑比值低于2%羧甲基纤维素，说明胃黏膜保护胶具有更好的触变性。

2.5 酸屏障作用实验

胃黏膜保护胶对不同浓度的盐酸溶液均有一定的隔离屏蔽作用，实验结果如表5所示。

表5 胃黏膜保护胶的酸屏障作用研究结果(n=3)Table 5 Acid barrier effect results of gastric mucosal protective gel(n=3)

3 讨论

目前临床上对EMR及ESD术后黏膜创面的修复途径主要有内镜下闭合、药物治疗、生物材料修复等。内镜下闭合主要利用止血夹、消化道闭合装置等；术后应用药物主要有黏膜保护剂及抑酸药物等；目前报道的生物材料有聚乙醇酸膜状材料、新生羊膜等。这些方法相对来说操作或使用复杂且效果有限。生物材料学科的发展为这一问题的解决带来了新的契机。理想胃黏膜保护及修复材料需具有以下特点：能够在术中通过管道抵达创面并迅速粘附；能适应胃内的特殊环境，抵御胃酸(pH值为0.9～1.5)腐蚀及胃蛋白酶的消化；能够牢固覆盖于创口表面，促进创面修复，但又不能过于坚硬，须顺应胃部蠕动特性；好的生物相容性[11]。

本研究进行了一种新型的海藻酸盐基胃黏膜保护胶的理化性能研究。一是针对胃黏膜保护胶主要应用于胃ESD术后，需要耐酸耐消化酶降解，测试了在同一pH值不同固化时间和不同pH值同一时间固化后的拉伸强度，发现固化时间越长、酸度越高时最大拉伸力越大；证明了该材料具有酸敏感性，即该材料遇酸发生相变由液体转化为胶体，并有一定的力学强度。二是由于手术中胃内特殊的环境，需要测试保护胶在该环境下的黏附率。针对这一问题设计了黏附实验，实验结果显示胃黏膜保护胶的黏附率较高，具有良好黏附性能。三是研究了胃黏膜保护胶对在胃蛋白酶条件下降解进行实验研究，发现在有和无胃蛋白酶的条件下该保护胶的降解率无显著性差异，该胶体具有抗酶解的性能。四是通过触变性能实验发现该产品在较高转速下可以降低黏度，在较低转速下黏度增高，具有触变性，可避免样品在注射部位的流动性。五是研究了该保护胶的酸屏障作用，利用Transwell小室设计酸屏障模型，证明该保护胶可以抵御酸的侵袭，对未愈合创面起到保护作用。本研究结果显示该保护胶有一定的临床应用价值，但还需充分对其生物相容性及有效性[16-18]进行研究，证明其安全性和有效性。

4 结论

本研究结果显示，海藻酸盐基胃黏膜保护胶具有抗酸解及酶解的特性，可在体内保持良好的形态；具有较好的组织黏附性及酸屏障隔离作用，可保护胃黏膜免受胃酸的刺激；具有良好的触变性，使其具有可注射性，且保持稳定的形态不易流动扩散。本实验的研究结果证明该胃黏膜保护胶是一种具有临床应用可能性的医疗器械产品。同时，本次研究针对的海藻酸盐基生物材料是在胃黏膜创面修复领域的首次应用，针对该材料凝胶剂型的研究也为胃黏膜创面保护及修复打开了新的思路。