Hedgehog及WNT信号通路在眼睑基底细胞癌中的研究进展

陈佳静，李超鹏，王其龙，王 飞

0 引言

相比于身体其他部位皮肤，眼周区域的癌症发生率较高[1]。其中，基底细胞癌(basal cell carcinoma, BCC)是该区域最常见的恶性肿瘤。诸多研究表明，多种分子信号的异常表达参与BCC的发生、发展过程。对眼睑BCC发生、发展及耐药发生过程中的肿瘤分子信号变化及其作用的深入探讨，对揭示其生物学行为与探索有效的防治方法具有重要意义。本文将对与眼睑BCC发生、发展相关的关键分子信号改变作一简要综述。

1 眼睑BCC及其特点

眼睑BCC占眼睑恶性上皮肿瘤的85%～95%，其次是鳞状细胞癌(SCC)、皮脂腺癌和恶性黑色素瘤[2]。危险因素包括毒素、感染因子、紫外线(UV)照射、局部和全身免疫功能障碍以及基因改变等。由于上眼睑有眉毛阻挡而受紫外线辐射较少，该病发生于下眼睑(48%)或内眦(27%)的比例高于上眼睑(25%)。2018年WHO病理学分型将该病分为结节型、浅表型、浸润型、硬化型和小结节型[3]。除了组织病理学分类外，基于基因组分析，BCC可分为三个亚型：(1)经典BCC，与Hedgehog和WNT信号通路密切相关；(2)类似正常的BCC，特别是表现出活跃的脂肪酸代谢者；(3)SCC样BCC，其依赖于免疫反应和氧化应激相关基因[4]。眼睑BCC治疗方式取决于患者的一般健康状况、组织病理学亚型、肿瘤的位置和大小，最常用和最有效的方法是将边缘清晰的病变采取莫氏显微手术或传统手术切除后进行眼睑重建，极小或浅表的病变(<2mm)可以用二氧化碳激光汽化或冷冻治疗，局部晚期BCC则使用药物治疗[5]。然而手术切除病灶后需要术者仔细地进行解剖和功能重建，并且手术部位可能因新的瘢痕形成引起眼睑位置异常，威胁眼表的健康。据统计，在106例下眼睑肿块切除和修复的病例中，7a内眼睑内外翻的发生率为14.2%。另外，术后并发症还包括眼睑挛缩、倒睫、眼睑边缘黏膜过度增生、泪腺损伤等[6]。眼睑BCC危害较大，该癌症可以通过造成眼睑皮肤破坏从而严重影响面部外观，甚至刺激结膜使患者视力下降[7]。此外，无论患者采用药物还是手术治疗，疾病复发也是常见的。因此，针对眼睑BCC复发率高、皮肤破坏风险高以及现有药物治疗方法产生耐药性的问题，进一步了解眼睑BCC发生的分子机制以及相关信号通路对其诊断和治疗具有重要意义。

2 与眼睑BCC发生相关的关键信号通路

2.1Hedgehog/GLI(Hh/GLI)通路Hedgehog/GLI(Hh/GLI)通路在毛囊发育过程中发挥重要作用，分为典型通路和非典型通路。该信号通路的失调是眼睑BCC发病的重要标志[8]。此途径通过一系列的配体如Sonic Hedgehog(SHH)、Indian Hedgehog(IHH)和Desert Hedgehog(DHH)，跨膜受体如Patched-1(PTCH-1)和转录因子Glioma-associated oncogene(GLI-1)促使细胞增殖，调节细胞死亡，保证干细胞的连续性，在造血系统、皮肤、神经系统和乳腺组织的干细胞自我更新过程中发挥作用[9]。

SHH是Hedgehog信号通路中研究最多、最广为人知的蛋白配体之一，它的中断会导致干细胞的发育异常。SHH通路激活表现为GLI的变化，该变化由SHH以浓度依赖的方式产生，即GLI的激活形式(GLIA)与抑制形式(GLIR)的总和[10]。最常见的GLI抑制机制是通过与Suppressor of fused(SUFU)基因结合，将GLI-1隔离在细胞质中，从而阻止核转位和Hh/GLI信号通路靶基因的进一步转录激活，据Zheng等研究，Negating Protein 1(SNEP1)和BCL-2均可抑制这一过程以促进Hh通路[11]。跨膜受体PTCH-1则是一种肿瘤抑制基因的蛋白产物，对Hh信号起负调控作用，通过抑制Smoothened(SMO)从而使Hh/GLI通路失效，它通常在散发性BCC中发生突变，其失活将可能导致基底细胞痣综合征的发生[12]。

2.1.1Hh/GLI典型信号通路可分为无配体结合与有相关配体结合两种情况。

2.1.1.1无配体结合在没有配体结合的情况下，PTCH-1抑制SMO作用，GLI转录因子被SUFU隔离，并被蛋白激酶A(PKA)、蛋白激酶1(CK1)和糖原合酶激酶3β(GSK3β)磷酸化，从而进行蛋白水解，其c端结构域分裂产生GLIR，随后GLIR易位进入细胞核，抑制Hh/GLI靶基因的转录，这些靶基因包括PTCH和GLI自身、WNT及与细胞增殖的相关基因等[13]。

2.1.1.2有相关配体结合在正常哺乳动物细胞中，当三种配体之一与受体结合时，Hedgehog信号传导得以实现。两者结合削弱了PTCH-1对SMO的抑制作用，从而使GLI免于蛋白水解。GLI全长形式是一种转录激活因子，可易位入核，促进Hh/GLI靶基因转录[14]。在BCC中，PTCH-1功能丧失或SMO突变均会提高GLI转录活性并触发表皮细胞中Hedgehog信号的过度激活。

典型的Hh/GLI信号通路局限于初级纤毛(primary cilium，PC)，尽管在发育过程中至关重要，但在疾病中并不广泛涉及。在mRNA和蛋白水平上，眼睑BCC的Hh相关分子中GLI-1表达最高，且在众多良恶性眼睑皮肤肿瘤中有且仅有基底细胞癌表达GLI-1，这些证据均提示GLI-1可作为鉴别基底细胞癌与其他恶性肿瘤尤其是基底样鳞状细胞癌的候选诊断标志物之一[15]。

2.1.2Hh/GLI非典型信号通路此为眼睑BCC的典型驱动方式之一，越来越多的证据表明，在癌症中，GLI活性的刺激与SMO无关[16]。非典型Hh/GLI信号通路的激活机制主要为以下两种。

2.1.2.1Ⅰ型非典型Hh/GLI通路在该通路中，PTCH-1不与SMO相互作用。当与配体结合时，PTCH-1使Caspase-3自身裂解，激活Caspase-9引发细胞凋亡；当PTCH-1与配体结合时，Caspase-9失活从而抑制其介导的细胞凋亡，此时Cyclin B1从PTCH-1受体的胞内结构域释放，促进细胞增殖[17]。

2.1.2.2Ⅱ型非典型Hh/GLI通路该通路依赖于SMO，但不依赖于GLI家族转录因子。据Shen等[18]研究发现SMO除了能够促进GLI家族转录因子的活性形式外，还具有功能性G蛋白偶联受体(GPCR)特性，对异质三聚体G蛋白具有选择性，通过这种特性能够不依赖GLI家族的转录因子激活Ⅱ型非典型通路。在基底细胞癌中，非典型Hh/GLI信号通路可能通过增强典型Hh通路促进肿瘤发生[19]。

根据最近的基因组分析，PTCH1的缺失和SMO的增加被认为是Hh通路基因的致病突变，占人眼睑BCC的90%。除此之外还有SUFU突变、TP53突变及NOTCH家族基因突变等，这些基因大部分被认为是肿瘤抑制因子，突变将导致其功能缺失，促进Hh/GLI信号表达，驱动肿瘤发生[20]。

2.1.3Hh/GLI抑制剂的开发随着对Hh/GLI信号通路的深入研究，Hh/GLI抑制剂的开发也获得了充足的发展，如Sonidegib、Vismodegib、Saridegib、BMS-833923、Aladegib、Glasdegib，这些都属于SMO抑制剂(SMOi)。而BCC也是第一个使用Hh/GLI通路拮抗剂治疗的瘤种[21]。Vismodegib是局部晚期BCC患者失去手术和放疗最佳时机的情况下唯二可用的靶向治疗之一，曾于2012年被美国食品药品监督管理局批准用于转移性和局部晚期BCC的治疗，已成为眼周BCC最常用的手术和放疗新辅助的治疗药物[22]。其对转移性BCC的最终缓解率约30%，对局部晚期BCC的最终缓解率约43%。有文献报道SMO和PTCH-1突变可作为眼睑BCC患者对Vismodegib治疗反应的预测性生物标志物[23]。然而，目前尚无足够的证据表明Vismodegib能显著改善患者的生存。Sonidegib是第二种获批的Hedgehog抑制剂，该抑制剂已成功应用于BCC的治疗。Saridegib于2018年获得FDA和EMA欧盟孤儿病药品委员会批准，可作为Gorlin综合征的突破性治疗指定外用凝胶，但该药物容易对发生SMO突变的高达50%的患者产生耐药性，最常见的是D437A突变，它使药物与SMO的亲和力显著降低[24]。当Hedgehog途径抑制失败时，使用PD-L1抑制剂Pembrolizumab获得了一定的治疗效果，这表明靶向PD-L1或与Hedgehog途径抑制剂联合使用可能能够成为眼睑BCC的有效治疗方案[25]。

SMOi和其他途径抑制剂的组合最有希望抑制实体肿瘤中Hh/GLI途径的过度激活并降低耐药性。而在一半的Vismodegib耐药患者中，Hedgehog信号元件的突变并不是导致出现耐药的原因，这有力地表明其他信号通路可能参与了疾病的进展。

2.2WNT信号通路WNT信号在表皮干细胞的发育、角质形成细胞增殖以及皮肤稳态再生中发挥作用，它从WNT配体与Frizzled(Fzd)家族的细胞表面受体结合后开始，与其他共受体如低密度脂蛋白相关蛋白(LRP5/6)或酪氨酸激酶受体(PTK7、ROR、RYK)结合，激活Dishevelled(Dvl)，最终触发多种信号级联。它的异常调控不仅会引起肿瘤的发生、发展，还能促进肿瘤复发。Yao等[26]在BCC中也观察到WNT通路的激活，表现为WNT蛋白的过表达(WNT1、2、5a、11、13、16等)和β-catenin的存在。β-catenin作为一种膜结合蛋白，是WNT的关键效应因子，定位于正常表皮的细胞膜、毛囊的细胞质和细胞核内，激活后易位入核[27]。WNT信号通路一般分为β-catenin依赖的典型通路(称为WNT/β-catenin信号通路)和β-catenin独立的非典型通路。

2.2.1WNT典型通路典型通路的激活以β-catenin依赖的转录活性为特征。

2.2.1.1无受体结合在没有受体的情况下，β-catenin被轴蛋白、腺瘤性大肠息肉蛋白(APC)、CK1和GSK3β组成的降解复合物捕获并磷酸化，β-转导蛋白(β-TrCP)与磷酸化的β-catenin结合，最终使其泛素化和蛋白酶体降解[28]。

2.2.1.2有受体结合当WNT与受体相互作用时，Dvl抑制上述复合物，使β-catenin免于磷酸化。未磷酸化的β-catenin进入细胞核，与T细胞因子(TCF)/淋巴增强因子(LEF)家族成员相互作用，触发WNT靶基因的转录，促进细胞周期蛋白D1和C-MYC等基因的表达，从而促进细胞增殖[29]。

WNT/β-catenin信号通路控制多种细胞功能，包括细胞增殖、分化和迁移，还在对损伤的急性反应起作用。除了TCF/LEF转录因子外，β-catenin可以与维生素D受体(VDR)结合。VDR为介导1,25(OH)2D发挥生物效应的核内生物大分子，Pálmer等[30]发现在没有VDR的情况下激活β-catenin信号会导致类似BCC的肿瘤发展。据报道，1,25(OH)2D可以通过提高质膜中与β-catenin结合的E-cadherin水平的方式进一步减少β-catenin与LEF/TCF结合进而转运进入细胞核。除此之外，它还可以通过刺激WNT拮抗剂DKK-1的表达抑制WNT信号，这提示1,25(OH)2D可能也可以成为BCC新的治疗手段[29]。

2.2.2非典型WNT通路独立于β-catenin，可分为WNT/Ca2+和WNT/平面细胞极性(PCP)途径。

2.2.2.1WNT/Ca2+途径在此途径中，WNT与Fzd相互作用激活磷脂酶C，将磷脂酰肌醇二磷酸(PIP2)转化为肌醇1,4,5-三磷酸(IP3)和1,2二酰基甘油(DAG)。其中，IP3与细胞内钙通道相互作用释放Ca2+离子，激活各种钙依赖激酶，如蛋白激酶C(PKC)、钙调蛋白依赖激酶Ⅱ(CAMKⅡ)和钙调蛋白磷酸酶(Cn)。有研究表明PKC能够激活小GTP酶；CAMKⅡ能使TGF-β激酶1(TAK1)磷酸化，诱导Nemo样激酶(NLK)的激活，从而抑制WNT/β-catenin信号的转录活性；Cn去磷酸化活化T细胞核因子(NFAT)家族蛋白并导致其核易位，使靶基因得以转录调控[31]。WNT/Ca2+通路的激活促进神经元系统的分化[32]，尚无研究表明与眼睑BCC的发生发展相关。

2.2.2.2WNT/PCP通路WNT配体与其受体的结合会激活RhoA家族小GTP酶，包括RhoA、RhoA相关蛋白激酶(ROCK)、Rac及其下游效应子、肌动蛋白结合蛋白Filamin A和c-Jun N端蛋白激酶(JNK),进而促进细胞迁移、侵袭或转移。其中，活化的JNK进一步触发活化蛋白-1(AP-1)家族转录因子的转录激活。AP-1蛋白同时也是多个信号如RAS通路的下游效应子，因此不难推断出WNT信号通路可通过AP-1与其他通路交叉作用。JNK/AP-1信号可启动RhoGEFs的转录程序，促进核心肌蛋白相关转录因子(nMRTF)活性。据研究显示，小分子AP-1抑制剂能够选择性地靶向lyypd3+/TACSTD2+/LY6D+ nMRTF人BCC，为改善联合治疗开辟了道路[33]。

典型WNT信号在BCC的起始和进展中起到关键作用，而非典型WNT信号重点在调控肿瘤侵袭和转移过程[34]，两种WNT信号通路可能以相互对抗的方式驱动BCC生长。

3 通路间相互作用

Hh和WNT信号之间的相互作用已被证明是协调胚胎发育、干细胞维持和肿瘤发生过程中关键过程的基础。既往研究表明，眼睑BCC的生长既需要WNT信号也依赖Hh通路，在正常皮肤发育过程中，两种信号通路缺一不可，前者启动毛囊的形成，后者促进细胞增殖形成成熟毛囊所需的上皮。WNT是SHH的靶基因之一，典型WNT信号先于Hh信号激活，并且是随后Hh信号激活所必需的。这两种信号之间的交叉也存在于BCC机制中。有研究发现作为脊椎动物WNT拮抗剂的WNT抑制因子1蛋白(WIF1)与人类SHH具有高亲和力，亦是人类SHH的有效拮抗剂[35]。WNT通路和Hh通路最惊人的相似之处为它们均是由密切相关的受体(分别为Fzd和SMO)介导的,并且均使用GSK3β、CK1和β-trcp来调节这些途径的关键转录效应因子的蛋白水解[36]。在晚期BCC肿瘤中显示GLI-1上调WNT基因，GLI-1和GLI-2与干细胞标记物如LGR4和LGR5有很强的相关性，而后两者为WNT信号通路的靶基因，该现象更能证明Hh和WNT信号在BCC癌变过程中存在联系。Steven等于表达致癌基因M2SMO的小鼠中发现了Hh通路驱动BCC发育中需要典型WNT信号通路的证据，此研究还表明阻断典型的WNT信号可以阻止Hh信号驱动的肿瘤发生[37]。因此，联合使用Vismodegib和WNT通路抑制剂治疗BCC相比起单药治疗更能抑制肿瘤生长[38]。

4 上述通路介导的BCC耐药及复发

WNT/β-catenin信号通路通过调节部分基因促进耐药，包括MDR-1、CD44、MMP7、IL-10等。Forkhead box O3(FOXO3a)作为β-catenin转录共激活因子之一，具有诱导细胞周期阻滞和细胞凋亡的作用，而在核β-catenin表达量高的情况下，该基因被PI3K或AKT抑制剂激活，使其表现为转移诱导因子而不是促凋亡的肿瘤抑制因子，从而使肿瘤对PI3K或AKT抑制剂产生耐药性[39]。抑制WNT/β-catenin信号通路可使癌细胞对化疗药物增敏，并提高免疫治疗的疗效。因此，研究靶向WNT/β-catenin通路的抑制剂对晚期和耐药BCC很有必要。

另外，由于在Hedgehog途径中负调控因子SUFU相对于SMO处在下游位置，SUFU突变可能对SMOi或针对该途径上游成分的其他治疗具有耐药性[40]。因此近年逐渐开发了针对SMO下游Hh-GLI的替代治疗策略，如酪蛋白激酶1(CSNK1)。证据表明，在SMOi敏感和耐药的肿瘤环境中，抑制CSNK1会干扰致癌的Hh信号，它的药理学靶向性为治疗SMO抑制剂敏感和耐药的肿瘤提供了一种新的治疗方法[41]。

已有研究表明，Vismodegib给药能使肿瘤从增殖状态转变为Hh抑制状态，该过程在停药时完全可逆，而在新的Vismodegib治疗周期又可重新诱导。Adriana等认为这可能与Lgr5+细胞的休眠有关，这些Lgr5+细胞在小鼠和人类BCC中都存在残余的WNT信号活性，并且可以被WNT和HH双重抑制剂靶向Lgr5+细胞联合Vismodegib消除，从而导致绝大多数BCC中的肿瘤根除[42]。由此可见，双重WNT和HH抑制可能成为避免BCC复发的重要临床治疗方案[43]。

5 结语

综上，对于易治疗的眼睑基底细胞癌，手术仍为一线治疗；但对于一些复杂的病灶，由于可能导致的毁容及眼部功能丧失，手术治疗往往并不可行。而替代疗法如放疗，在眼部这个高度敏感的解剖区域也具有严重的副作用，因此药物靶向治疗局部晚期基底细胞癌(laBCC)尤为重要[44]。

目前最常用于眼睑BCC的药物为抑制Hh通路的Vismodegib，它为眼周区域的laBCC提供了一种有希望的能替代破坏性手术或放疗的选择。虽然相当多的患者即使停用此药，也可以长时间实现肿瘤完全消退，但患者服用该药期间均发生至少一次不良反应，最常见的不良反应为肌肉痉挛，其次为味觉障碍、脱发和体质量减轻，甚至出现肝毒性，其中味觉障碍是主要的停药原因[45]。近年来亦有用Sonidegib成功治疗眼周laBCC的病例，但其长期疗效和并发症仍有待于进一步研究[46]。Marco等研究发现WIF1在小鼠体内移植后抑制肿瘤生长和增殖，在体外培养的BCC细胞系中没有抑制作用，但目前没有获得批准运用于人眼睑BCC治疗中[47]。过去几年，Hh信号通路及Wnt信号通路已经在眼睑BCC的机制研究方面取得了很大的进步，但目前针对抑制剂的应用尚不够深入，继续进行深入研究可为探索BCC的治疗方式上提供一定的参考方向。另外，是否多种抑制剂联合使用能达到治疗眼睑BCC的最佳效果也需要我们进一步探索。

眼睑BCC的形成是细胞信号调控机制中的某些环节发生紊乱造成的，除了上述信号通路参与肿瘤的发生、发展,还有其他途径共同参与眼睑BCC的疾病进展，如TGF-β途径、JAK-STAT途径、AKT途径、MAPKs信号通路、NOTCH途径、TP53、MYCN、YAP1和TAZ信号通路等[48-50]。尽管目前对于眼睑BCC的发生机制仍未完全明确，且研究方向多较分散，但随着高通量测序的技术发展，人们对基因水平的研究逐渐深入，对多种信号通路的靶点逐渐清晰，将研制出更多针对新靶点的药物，以期延长患者的生存期及提高患者的生活质量。