摩泽蒲螨携带杀虫真菌靶向防治光肩星天牛*

唐汉尧 郑吉阳 王 敦

(西北农林科技大学昆虫学研究所 杨凌 712100)

光肩星天牛(Anoplophoraglabripennis)属于鞘翅目(Coleoptera)天牛科(Cerambycidae)沟胫天牛亚科 (Lamiinae)星天牛属 (Anoplophora)，其分布广泛，是世界性严重的林业蛀干害虫，对杨树 (Populusspp.)、柳树 (Salixspp.)、榆树 (Ulmusspp.)等阔叶树造成毁灭性危害。在我国， 1937年刘鹤昌先生首次报道并简要描述了光肩星天牛(高瑞桐等， 2001)。据记载，光肩星天牛以前一直为一般性害虫，很少暴发成灾。1978年，我国启动了“三北”防护林建设工程，为尽快改善我国西北地区恶劣的生态环境，选择了适应能力强、生长速度快的杨树为主要造林树种。由于防护林树种单一，造成光肩星天牛暴发成灾； 由于光肩星天牛生活习性隐蔽，防治困难； 因此，数以万计的林木被害致死，造成了巨大的经济损失，并对西北地区的生态环境造成极大破坏(骆有庆等， 1999)。此后，该虫逐步发展为林业主要害虫。

目前，光肩星天牛几乎在我国全国范围内均有分布。近年来，新疆、西藏也有发现杨树等树种被危害(杨忠岐等， 2018)。其中，宁夏、甘肃和内蒙古地区的危害最为严重(王哲等， 2016)。光肩星天牛在甘肃对天然次生白桦(Betulaplatyphylla)林也造成了严重危害(高瑞桐等， 2009)。在国外，光肩星天牛作为入侵物种，为害美国、加拿大两国常见的枫树 (Acerspp.)，使当地的林木遭受到严重危害 (Pedlaretal., 2020; Daraetal.， 2019)。随后，光肩星天牛又传播到欧洲一些国家，其对农业防风林、种植园、城市街道、森林地区均构成严重威胁 (Javaletal., 2017)。

防治光肩星天牛最直接有效的方法是施用化学农药，近年来不断筛选高效低毒农药并优化施药方式(于斌等， 2021； 高玉梅等， 2010)。然而在不污染环境的前提下，生物防治是首选， 近年来也筛选出了花绒寄甲 (Dastarcushelophoroide)、白蜡吉丁肿腿蜂 (Sclerodermuspupariae) 等优良天敌(杨忠岐等， 2018)； 昆虫病原真菌的筛选及施用方式也有大量研究，多以无纺布菌条防治成虫为主(Cliftonetal., 2020; Daraetal.， 2019; Shanleyetal., 2009)。现有防治光肩星天牛的方法在实验室内和野外片区效果很好，但在大面积林区的防效会大打折扣，且难以解决工作量大、成本高的问题(Cliftonetal., 2020; 杨忠岐等， 2018； 王嘉冰等， 2017)。目前能有效控制光肩星天牛的技术不多 (Dhandapanietal., 2020)。

摩泽蒲螨 (Pyemotesmoseri) 属于蜱螨目(Acarina)蒲螨科(Pyemotidae),是一种广谱性的寄生螨，雌雄比和寄生率高，具有很强的攻击能力和搜索寄主能力，是非常优良的蛀干害虫天敌(张彦龙等， 2017)。摩泽蒲螨能有效控制我国野生的新疆野苹果 (Malussieversii) 上的毁灭性害虫苹小吉丁虫 (Agrilusmali) (Cuietal., 2019)； 在室内能成功寄生台湾狭天牛 (Stenhomalustaiwanus) 幼虫、苎麻天牛 (Paragleneafortunei) 蛹(张彦龙等， 2017)； 但对于较为活跃的幼虫较难形成有效寄生，林间应用摩泽蒲螨防治光肩星天牛尚无成功实例。由于摩泽蒲螨个体微小、活力强、能主动搜寻生活场所隐蔽的害虫，亦可靠风力扩散(马立芹等， 2009)，非常适宜作为媒介生物携带传播昆虫病原菌来防治蛀干害虫，但截至目前尚未见到相关研究报道。本研究利用摩泽蒲螨为媒介生物，让摩泽蒲螨携高效生防菌真菌孢子进入光肩星天牛幼虫的蛀道，从而将真菌孢子传播给光肩星天牛幼虫，使其感染真菌死亡。解决昆虫病原真菌较难达到天牛幼虫体上而感染寄主的技术瓶颈，尝试采用较低的防治成本和工作量，达到高效便捷、有效生物防治光肩星天牛的效果。

1 材料与方法

1.1 媒介生物

室外模拟防治试验和林间防治试验所用的摩泽蒲螨成熟膨腹体购自北京香林佳业科技有限公司(北京昌平)。

1.2 昆虫病原真菌

试验所用昆虫病原真菌Ma1为金龟子绿僵菌 (Metarhiziumanisopliae)，分离自实验室饲养的蛴螬。Bb-LHS为球孢白僵菌 (Beauveriabassiana)，分离自内蒙古乌兰察布老虎山公园染菌的光肩星天牛幼虫。2种昆虫病原真菌均由西北农林科技大学昆虫与微生物资源利用实验室鉴定并保存。

1.3 释放装置

将摩泽蒲螨成熟膨腹体放置于5 mL离心管底部，用小号平头排笔蘸取由实验室培养提供的昆虫病原真菌孢子粉，将其刷在管口内壁，形成一层宽度约1.5cm的真菌孢子粉环带。所刷孢子粉与无菌水混合后，经血球计数板测定其孢子含量为1.08×109个·mL-1。当子螨爬出离心管后，体表就会携带上真菌孢子。

1.4 试验样地

1.4.1 室外模拟防治试验样地 在陕西省咸阳市西北农林科技大学南校区绿化地内，试验所用受害杨树木段由甘肃省酒泉市肃州区林业资源管理站提供，受害木段为新疆杨 (Populusalba)。

1.4.2 林间防治试验样地 在甘肃省酒泉市肃州区石河桥道班林地内(海拔1400 m左右，98°36′38″E，39°46′10″N)。受害树种为新疆杨和二白杨 (P.gansuensis)，种植密度大，每棵树有光肩星天牛排粪孔上百个。

1.5 试验方法

1.5.1 室外模拟防治试验 将受光肩星天牛危害的长1.0 m左右，直径10～15cm的杨树木段按自然生长方向下端植于室外土壤中，每日浇水，保证杨树木段存活。用蚊帐罩住各组木段，每日检查3次，及时采集羽化的成虫并统计，防止光肩星天牛逃离后在当地扩散。分别用胶带在每根木段顶部固定释放装置，淹没释放。一共设置5组不同处理，每个处理(含对照)3个重复、每个重复10个木段，具体如下：

摩泽蒲螨和球孢白僵菌处理组(P-Bb-LHS)： 释放装置内有摩泽蒲螨和球孢白僵菌；

摩泽蒲螨和金龟子绿僵菌处理组(P-Ma1)： 装置内为摩泽蒲螨和金龟子绿僵菌；

金龟子绿僵菌和球孢白僵菌处理组(Ma1-Bb-LHS)： 装置内为金龟子绿僵菌和球孢白僵菌；

摩泽蒲螨处理组(P)： 装置内只有摩泽蒲螨；

无螨无菌组(N)： 为空白对照组，装置内无螨无菌。

统计防治前后每根木段排粪孔数量、羽化孔数量，并在防治1个月后剖开木段，检查光肩星天牛死亡情况。

1.5.2 林间防治试验 2021年8月在甘肃省酒泉市石河桥道班，选择光肩星天牛危害严重的杨树作为中心母树，用尼龙扎带将内有螨和真菌孢子的释放装置固定在母树上，固定位置于距地面高度1 m左右的侧枝上，管口朝向主干且略倾斜向下。防治所用真菌为Ma1和Bb-LHS的混合孢子粉，淹没释放。统计防治前和防治1个月后母树及周围杨树距地面高度2 m以下排粪孔数量，确定蒲螨传播直径。

1.6 昆虫病原真菌感染天牛幼虫的鉴定方法

挑取室外模拟防治试验中死亡虫体体表的菌丝，按照Aljanabi等 (1997) 的方法提取菌丝总DNA，再以提取的总DNA为模板，选用3对引物分别进行PCR扩增及测序，在GenBank中进行BLAST分析确定真菌种类，同时与试验所用杀虫真菌的同源序列比对，以确定是否为试验所释放真菌菌株。PCR所用引物序列、体系及反应条件(孟云等， 2021)如下：

ITS1 : 5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′

ITS2 : 5′-GCTGCGTTCTTCATCGGATGC-3

EF1α-EF : 5′-GCYCCYGGHCAYCGTGAYTTY AT-3′

EF1α-ER : 5′-ATGACACCRACRGCRACRGTY TG-3′

nrSSU-CoF : 5′-TCTCAAAGATTAAGCCATGC-3′

nrSSU-CoR : 5′-TCACCAACGGAGACCTTG-3′

PCR体系 (25μL) ： dd H2O 17.7μL，10×PCR Reaction Buffer 2.5μL，dNTPs (2.5mmol·L-1)2μL，正、反向引物 (10μmol·L-1) 各 0.5μL，0.1% BSA 0.3μL，Taq酶(5 U·μL-1)0.5μL，DNA模板1μL。

ITS基因的PCR反应条件： 95℃ 5min； 95℃ 30 s、60℃ 30 s、72℃ 1min，35个循环； 72℃ 10min。

TEF基因的PCR反应条件： 95℃ 4min； 94℃ 50 s、56℃ 50 s、72℃ 70 s，循环8次，每循环退火温度降低0.5℃； 94℃ 50 s、52℃ 50 s、72℃ 70 s，循环25次； 72℃ 10min，12℃保存。

nrSSU基因的PCR反应条件： 95℃ 4min； 94℃ 50 s、56℃ 50 s、72℃ 2min，循环8次，每循环退火温度降低0.5℃； 94℃ 50 s、52℃ 50 s、72℃ 2min，循环25次； 72℃ 10min，12℃保存。

1.7 数据处理

用GraphPad 8.0.2软件检验处理之间的差异性，并进行数据统计分析和作图。

2 结果与分析

2.1 室外模拟防治试验

2.1.1 防治前后光肩星天牛排粪孔数变化 防治1个月后，摩泽蒲螨和球孢白僵菌处理组(P-Bb-LHS)的木段排粪孔减少比例为77.0%(图1左)，极显著高于金龟子绿僵菌和球孢白僵菌处理组(Ma1-Bb-LHS)、摩泽蒲螨处理组(P)、无菌无螨组(N)的木段 (P<0.01) 。摩泽蒲螨和金龟子绿僵菌处理组(P-Ma1)的木段排粪孔减少比例为83.1%(图1右)，极显著高于Ma1-Bb-LHS、P、N 3组的木段 (P<0.01) 。

图1 不同处理组平均每根木段的排粪孔减少比例

图2 不同处理组平均每根木段的羽化孔增加比例

图3 不同处理组平均每根木段的天牛死亡率

图4 剖开木段后的光肩星天牛

2.1.2 防治前后光肩星天牛羽化孔数变化 摩泽蒲螨和球孢白僵菌处理组(P-Bb-LHS)、摩泽蒲螨和金龟子绿僵菌处理组(P-Ma1)的木段羽化孔增加比例为0(图2)。金龟子绿僵菌和球孢白僵菌处理组(Ma1-Bb-LHS)的木段羽化孔增加比例为21.3%，极显著高于P-Bb-LHS和P-Ma1组的木段(P<0.01) 。摩泽蒲螨处理组(P)、无菌无螨组(N)的木段羽化孔增加比例分别为18.7%和18.0%，均显著高于P-Bb-LHS组和P-Ma1组的木段 (P<0.05)。

2.1.3 防治后光肩星天牛的死亡率 防治1个月后剖开木段检查，金龟子绿僵菌和球孢白僵菌处理组(Ma1-Bb-LHS)、摩泽蒲螨处理组(P)、无菌无螨组(N)3种处理的木段天牛死亡率为0(图3)。摩泽蒲螨和球孢白僵菌处理组(P-Bb-LHS)的木段天牛死亡率为85.0%，摩泽蒲螨和金龟子绿僵菌处理组(P-Ma1)的木段天牛死亡率为77.5%(图3)，两种处理木段天牛死亡率均极显著高于P-Bb-LHS、P、N 3组的木段 (P<0.01) 。P-Bb-LHS和P-Ma1两组的木段内虫道发黑，内有感染真菌死亡的天牛幼虫(图4)。

2.1.4 天牛幼虫感染真菌的分子鉴定结果 摩泽蒲螨和球孢白僵菌处理组(P-Bb-LHS)，死亡光肩星天牛幼虫虫体表面菌丝，3种引物的分子鉴定结果均为球孢白僵菌 (Beauveriabassiana)，同源性均在99%以上； 并序列与试验所用菌株Bb-LHS序列完全一致。

2.2 林间防治试验

防治1个月后发现，以母树为中心，直径2 m范围内杨树排粪孔减少比例为79.5%，直径2～4 m范围内杨树排粪孔减少比例为77.5%(图5)。当直径逐步扩大时，排粪孔减少比例逐渐降低。传播直径8～10 m时，排粪孔减少比例为55.2%； 传播直径10～12 m时，排粪孔减少比例为43.9%； 传播直径大于12 m时，排粪孔减少比例仅有28.7%。

图5 不同传播直径排粪孔的减少比例

3 讨论

自然界中的蒲螨主要依靠风力传播扩散，降落后爬行搜索寄主(马立芹等， 2009)，故其扩散能力并不能局限于其爬行速度和能力。本研究表明蒲螨携带真菌孢子的水平传播直径10 m范围内可以产生显著的防效，如果存在风力等利于蒲螨传播的自然因素，其防治有效面积将进一步增大。对于受害严重的林区，采用淹没释放方式也不失为一种有效策略。尽管有报道利用杀虫真菌来防治天牛，但都是针对羽化飞出的成虫(Gobleetal., 2014; Hajeketal., 2008)，能够对成虫形成一定的感染率，但无法突破树干屏障去感染蛀道内的幼虫。本研究利用蒲螨突破了真菌难以有效抵达蛀道内天牛幼虫的屏障，对于已经报道能够感染天牛的杀虫微生物而言，将会是一个强有力的辅助感染手段。

与昆虫病原真菌联用最广泛的天敌是捕食螨，目前最大的争议是真菌是否会侵染捕食螨，导致对害虫的防效降低，因为当捕食螨取食猎物后，其腹部侧面会膨胀，暴露的膜质部分更易受真菌侵染(吴圣勇等， 2019)。蒲螨在昆虫体外寄生时，腹部膜质末端会膨大形成膨腹体(马立芹等， 2009)，存在被真菌感染的可能性。考虑到本研究只是利于蒲螨去传播真菌孢子，即使蒲螨被真菌感染，直到蒲螨染菌致死需要1周以上时间，在此期间蒲螨已成功进入蛀道、并抵达天牛幼虫虫体，已经有效完成真菌孢子的靶向传递。被真菌感染的蒲螨最终会在蛀道内死亡，死亡虫体一样可以作为感染源产生真菌孢子、并形成持续传播，反而有利于感染天牛幼虫。未被真菌感染的蒲螨依然可以寄生天牛蛹，能够弥补单独释放蒲螨只能寄生天牛蛹而不能成功寄生天牛幼虫的缺陷(李叶晨等， 2019； 胡帅等， 2013)，对于利用蒲螨防治天牛或其他蛀干害虫能够起到防效叠加作用。

由于天牛隐蔽性生活和危害，幼虫虫道均在树干内，一般药剂很难抵达幼虫危害部位(余汉鋆等， 2017)。因此，在天牛防治实践中，对发生相对较轻的林区，生产单位多用寄生性天敌来防治天牛，天敌昆虫可以突破树干屏障对天牛幼虫和蛹形成有效的控制(杨忠岐等， 2018)。但当天牛危害严重时，天敌昆虫控害作用则会被弱化，生产单位往往采用高剂量的化学农药来防治成虫，以有效压制林间天牛种群数量(吕云彤等， 2018)。但光肩星天牛世代不整齐，在陕西、甘肃等地，每年4—10月均有成虫出现(高瑞桐等， 2001)，化学农药大面积、大量、长时间使用，不仅会造成严重的环境污染，也会对释放的天敌昆虫造成毁灭性影响。因此，避免化学农药的使用、寻求能够与天敌昆虫协同控害的生物防治手段，将是控制天牛类害虫的合理途径。利于蒲螨来传播天牛的病原真菌，可以与其他生物防治技术协同发挥作用，尽可能地减少或避免大面积喷施化学农药，不仅可以达到减少环境污染和保护天敌的作用，也有望缓解大规模化学农药防治和利用天敌生物防治之间的矛盾。

该技术为防治隐蔽危害的光肩星天牛提供了一种新的方法，能够通过较为简单、高效的手段，来有效地使蛀道内的天牛幼虫感病死亡。同时，本研究为其他蛀干害虫生物防治提供了新的思路。

4 结论

本研究利用摩泽蒲螨作为媒介生物传播昆虫病原真菌进行试验，结果表明，能成功将真菌孢子传播到光肩星天牛幼虫蛀道中，病原真菌靶向性感染天牛幼虫并最终致死天牛。室外模拟实验表明，蒲螨能够有效携带真菌孢子进入天牛蛀道，成功感染天牛幼虫并造成85.0%光肩星天牛幼虫死亡。林间防治试验结果表明，蒲螨携带真菌孢子的水平传播直径为10 m，在这个范围内排粪孔数量减少50%以上，表明具有显著的防效。