不同致病力松材线虫对红松早期防御酶活性影响*

曹业凡 王曦茁 汪来发 汪 祥 徐 明 苏胜荣 郭 伟

(1.中国林业科学研究院森林生态环境与自然保护研究所 国家林业和草原局森林保护学重点实验室 北京 100091； 2.江苏省林业科学研究院 南京 211153； 3.黄山学院生命与环境科学学院 黄山 245041； 4.吉林省林业和草原局 长春 130000)

松材线虫病又称松树萎蔫病，是一种以松材线虫(Bursaphelenchusxylophilus)为病原，墨天牛属(Monochamus)昆虫为媒介的系统性病害(叶建仁， 2019； Futai， 2013)，主要危害松科植物，目前该病害已蔓延扩散至中国、日本、韩国、葡萄牙和西班牙等多个国家(Wangetal., 2010;Abelleiraetal., 2011;Shinyaetal., 2013)。据国家林业和草原局2022年6号公告统计，目前我国大陆地区松材线虫病县级疫区数为731个，新增县级疫区22个，病情由南向北不断蔓延扩散，形势严峻。松材线虫的寄主植物分布广泛，包括自然感病寄主与人工接种感病寄主在内共计106种松科(Pinaceae)植物，其中大部分属于松属(Pinus)，主要包括黑松(P.thunbergii)、马尾松(P.massoniana)、思茅松(P.kesiyavar.langbianensis)、油松(P.tabulaeformis)等(叶建仁， 2010； Shietal., 2012)。韩国于2006年最早发现红松(P.koraiensis)松材线虫病(Hanetal.， 2006)，经科赫氏法则验证确认红松为松材线虫病新寄主，我国2017年后相继发现红松感染松材线虫病(于海英等， 2018； 潘龙等， 2019)。

当植物处于逆境胁迫环境时，会产生过多活性氧(ROS)。当活性氧累积过量时，会导致植物受到过氧化伤害，因此植物在逆境胁迫下抗氧化系统会被激活并分泌大量抗氧化酶，进而抵御逆境带来的氧化伤害(Cha-UmSetal., 2009)。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、过氧化氢酶(catalase, CAT)、苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia-lyase,PAL)与过氧化物酶(peroxidase, POD)是ROS水解过程中重要的4种氧化酶，参与活性氧清除及酚类、木质素和植保素等抗病相关物质的合成，能抵御活性氧及氧自由基对细胞膜系统的伤害，使植物抵抗病害的能力增强，是植物体内重要的防御酶(何利等， 2013)。谢婉凤等(2018)研究发现，2年生马尾松苗接种松材线虫后SOD与POD活性下降，且相关基因的表达也受到影响。滕涛等(2013)通过对1年生不同抗性种源马尾松进行线虫接种并进行防御酶活性测定发现，抗性种源POD活性均大于易感种源，表明POD活性动态变化与不同地理种源马尾松的抗病能力有关。秦世杰等(2021)通过对自然感病状态下的油松进行防御酶活性测定发现，感病油松PAL与CAT活性与对照组差异极显著，但目前对红松感染松材线虫后防御系统的变化研究鲜见报道。鉴于此，本研究通过对接种不同株系松材线虫后4年生红松幼苗的早期相关防御酶进行活性测定，分析早期防御酶活性变化与同株系松材线虫致病力的相关性，以期了解红松感染松材线虫后的生理生化反应，为研究松材线虫的致病机制及相应寄主抗病特征提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

松材线虫株系号及其来源： 1) QH-1：采自沈阳清原的感病红松； 2) NM-1：采自南京溧水的感病马尾松； 3) CM-1：采自重庆的感病马尾松。按常规方法分离纯化和培养松材线虫。通过贝尔曼漏斗法从疫木中分离得到线虫后，接种于长满灰葡萄孢(Botrytiscinerea)的PDA培养皿内，于25℃黑暗条件下培养线虫。待培养皿内取食完毕后，通过贝尔曼漏斗法分离线虫得到线虫悬浮液，将其线虫含量调整为20条·μL-1。

本试验所用幼苗为4年生红松实生苗，培养于中国林业科学研究院内苗圃地，备用。

1.2 试验方法

1.2.1 接种线虫 接种方法参照Qiu等(2016)方法。每个株系接种21株红松幼苗，空白对照组接种21株幼苗。用消毒解剖刀在4年生红松幼苗中部偏下约2cm位置，由上到下割开树皮形成约0.5cm的纵切口，撕开韧皮部后放入大小适宜的棉球，使用封口膜将棉球包裹呈漏斗状，通过手持移液器对棉球注入100 μL线虫悬浮液，对照组注入等量无菌水。用透明胶盖住漏斗上部便于保湿，接种完成后置于室外培育，定期浇水保湿。

1.2.2 样品采集及预处理 接种完成后，持续1周对接种红松幼苗进行取样，取样部位为接种点附近的当年生嫩枝针叶，每个时间点取生物学重复3组。样品采集完成后，立即将样品储存于10 mL离心管内，将离心管置于液氮中浸泡1min后，储存于-70℃冰箱保存备用。SOD、CAT、PAL与POD活性测定试剂盒由苏州科铭生物技术有限公司提供，测定方法参照试剂盒说明书。

1.2.3 致病性测定 致病性测定接种方法参照1.2.1，每株系接种红松幼苗10株，接种量为每株2 000条，以无菌水接种为对照。接种后，持续观察接种幼苗发病情况，统计松苗发病率，感病指数与死亡率计算参照徐福元等(1994)并稍作改进。接种35天后，统计各株系松苗发病率，对所有植株分别进行线虫分离与计数统计。完成致病性测定后，对不同株系松材线虫进行致病力统计。

发病率=发病株数/接种株数×100%。

感病指数=∑(各级株数×各级代表数值)×100/调查总株数×发病最重级的代表数值。

平均发病等级=∑(各级株数×各级代表数值)/调查总株数

1.2.4 防御酶活性变化幅度与致病力相关性分析 SOD、CAT、PAL与POD活性最大变化幅度测定方法参照1.2.2，致病力统计结果参照1.2.3中公式。对上述数据绘制折线图，分析不同株系松材线虫与不同防御酶活性变化幅度相关性。

1.3 数据处理

采用SPSS 13.0进行差异显著性分析及Ducan多重性比较，绘图软件采用Sigmaplot 14.0。

2 结果与分析

2.1 SOD活性变化

SOD活性变化结果表明，接种2天后，除松材线虫株系CM-1处理与空白对照组外，其他处理组红松幼苗SOD活性均出现小幅度上升(图1)，随后2～4天内，所有处理组SOD活性均有不同程度下降，其中QH-1处理组SOD活性下降幅度最大。接种第5天后，QH-1处理组SOD活性开始大幅度上升，随后SOD活性持续下降直至接种7天后达到最小值，而NM-1与CM-1处理组SOD活性在接种5天后均呈下降趋势，随后NM-1处理组SOD活性呈先上升后下降趋势，CM-1呈先下降后上升趋势，无明显变化。接种7天后，QH-1、NM-1和CM-1处理组与CK组相比分别下降36.7%、17.7%和12.1%。因此，红松幼苗接种QH-1株系线虫后SOD活性变化幅度最大。

图1 接种不同株系松材线虫后的红松SOD活性变化

2.2 CAT活性变化

接种2天后，除QH-1处理组与CK组红松幼苗CAT活性呈小幅上升趋势外，其他处理组幼苗CAT活性出现小幅度下降(图2)。随后2～4天内，NM-1与CM-1处理组CAT活性均呈先上升后下降变化趋势，而QH-1处理组CAT活性呈先下降后上升变化趋势。接种第5天后，除CK组外所有线虫处理组CAT活性呈小幅度下降。接种6～7天后，所有线虫处理组CAT活性呈先上升后下降趋势变化，其中QH-1处理组活性最低，与CK组相比下降幅度为52.1%，而NM-1、CM-1处理组CAT活性与CK组相比分别上升10.6%、7.5%。因此，红松幼苗接种QH-1株系线虫后CAT活性下降幅度最大。

2.3 POD活性变化

接种2天后，所有线虫处理组红松幼苗与CK组相比POD活性呈上升趋势变化，这表明对松材线虫感染有积极的响应作用。其中QH-1处理组POD活性最高(图3)，CM-1处理组POD活性达到最高值。接种3天后，QH-1与NM-1处理组POD活性达到最高值。接种4～6天内，所有处理组POD活性均呈先下降后上升趋势变化，其中QH-1处理组POD活性下降幅度最大。接种第5天后，除CK组外所有线虫处理组POD活性呈小幅度下升。接种6～7天后，所有线虫处理组POD活性呈先下降趋势变化，其中QH-1处理组活性最低。接种7天后QH-1、NM-1和CM-1处理组与CK组相比分别上升3.3%、21.9%和16.3%，与最大值相比分别下降12.8%，33.5%和10.1%。

2.4 PAL活性变化

接种2天后，所有线虫处理组红松幼苗PAL活性均高于与CK组，此时QH-1处理组PAL活性最高(图4)，NM-1处理组活性最低。接种3～6天后，NM-1与CM-1处理组PAL活性虽有波动但无明显变化，而QH-1处理组PAL活性呈先下降后上升趋势变化，且在接种第5天后达到最小值。接种7天后，所有处理组PAL活性均高于CK组，其中QH-1处理组与CK组相比上升111%，NM-1、CM-1处理组与CK组相比分别上升46.3%、46.9%。

2.5 不同株系松材线虫对红松的致病力

接种试验表明，QH-1、NM-1与CM-1株系松材线虫均能使4年生红松幼苗枯萎发病(表1)。症状观察结果表明，感病初期接种点附近针叶开始褪绿变黄，感病中期整株针叶变黄，其中接种点附近针叶开始变红。感病后期整株针叶枯萎变红并停止流胶，此时接种幼苗已枯萎死亡(图5)。

图2 接种不同株系松材线虫后的红松CAT活性变化

图3 接种不同株系松材线虫后的红松POD活性变化

表1 4年生红松幼苗接种松材线虫的发病率、感病指数与再分离线虫量(接种后35天)①

图4 接种不同株系松材线虫后的红松PAL活性变化

图5 接种松材线虫后的红松外部病状

图6 接种不同株系松材线虫后红松幼苗平均发病等级变化

病程记录结果表明，不同株系松材线虫接种红松后的首次发病时间与致病进程存在明显差异(表1)。接种QH-1的幼苗在10天时针叶开始出现褪绿黄变，于20天时出现针叶枯萎变红，而接种NM-1和CM-1的幼苗于15天左右才开始出现针叶褪绿变黄症状，30天时出现针叶枯萎变红(图5)。发病率统计结果表明，接种5周后，接种QH-1的红松幼苗发病率为100%，接种NM-1和CM-1的发病率分别为60%和40%。感病指数统计结果表明，接种QH-1株系松材线虫2年生红松幼苗感病指数为100，接种NM-1和CM-1的红松幼苗感病指数分别为55和30。平均发病等级变化结果表明，接种35天后接种QH-1发病等级最高，此时接种QH-1红松幼苗全部萎蔫死亡，而接种NM-1与CM-1红松幼苗平均发病等级未达到4，尚未全部死亡(图6)。

接种35天后萎蔫植株中的再分离线虫量表明(表1)，在接种QH-1、NM-1和CM-1后枯萎发病的红松幼苗内均能分离到松材线虫，在接种QH-1后枯萎的红松幼苗平均每株分离的线虫量为(28 776±4 774)条，而接种NM-1与CM-1后枯萎的红松幼苗平均每株分离的线虫量分别为(19 290±3 502)条和(19 737±3 501)条，数量差异显著(P<0.1)。

致病力统计结果表明，QH-1、NM-1和CM-1株系松材线虫对4年生红松幼苗致病力存在差异，来自相同寄主的松材线虫株系QH-1对红松的致病力要大于来自马尾松的松材线虫株系NM-1和CM-1。

2.6 红松接种不同株系松材线虫后的酶活变化幅度

由图7可知，红松幼苗接种不同致病力株系线虫后酶活性变化幅度存在差异。QH-1处理组防御酶活性变化幅度由大到小依次为PAL、CAT、SOD与POD，最大变化幅度为117%。NM-1处理组防御酶活性变化幅度由大到小依次为PAL、SOD、CAT与POD，最大变化幅度为46.3%。CM-1处理组防御酶活性变化幅度由大到小依次为PAL、POD、SOD与CAT，最大变化幅度为46.9%。所有线虫处理组中PAL活性变化幅度最大，且接种强致病力松材线虫株系QH-1后，感病红松防御酶活性变化幅度最大。

图7 接种不同株系松材线虫后红松幼苗防御酶活性变化幅度

3 讨论

本研究发现，4年生红松在接种不同株系松材线虫后的防御酶活性变化存在明显差异，结合后期致病性统计结果，发现接种强致病力株系松材线虫后，接种幼苗防御酶活性变化幅度大于弱致病力处理组酶活性变化幅度。因此，通过测定接种植株的早期防御酶活性变化，可以从侧面反映不同株系松材线虫致病力强弱，致病力强弱与寄主感病早期防御酶活性变化存在一定相关性。

3.1 松材线虫对接种红松幼苗防御活性影响

SOD主要通过催化ROS歧化反应，使得ROS生成H2O2和O2，进而保护植物避免或减轻ROS损伤(夏民旋等， 2015)。Song等(2015)通过利用黄瓜花叶病毒(cucumber mosaic virus, CMV)侵染黄瓜和西红柿(Solanumlycopersicum)叶片，发现两者叶片中SOD的活性均上升，表明CMV通过激活黄瓜(Cucumissativus)防御酶系统，导致SOD活性上升。谢婉凤等(2018)通过对接种松材线虫后马尾松进行SOD活力测定，发现SOD活力比对照组显著下降。因此，当植物处于逆境胁迫时，SOD活性会出现不同程度的上升与下降，这可能与该植物抗病性与感病程度相关。本研究中，所有线虫处理组SOD活性在接种7天后均显著低于对照组，说明红松幼苗感染线虫后，SOD活性降低导致病害程度加深，且QH-1处理组活性下降程度最大，后续病害统计结果也显示QH-1对4年生红松致病力最强。因此，QH-1处理组SOD活力大幅下降可能是因为QH-1对接种植株致病力最强，进而加快接种植株发病进程。

CAT和POD是分解H2O2的主要氧化酶类。当植株由于ROS反应产生大量H2O2后，CAT和POD能够将H2O2分解为H2O，防止因自身免疫反应造成细胞损伤。因此，CAT与POD在植物抗病过程中作用重大。陈玉莲等(2015)通过测定接种松材线虫后不同家系马尾松防御酶活性发现，CAT与POD活性变化趋势与松材线虫病的感病指数相关，且活性在接种后都表现出先上升后下降的趋势。刘洪剑等(2018)通过对不同抗性家系马尾松接种松材线虫并测定防御酶酶活性变化发现，CAT与POD变化趋势与陈玉莲等(2015)研究结果相似。本研究中所有线虫处理组CAT与POD活性在接种线虫1天后，均高于CK组，可能是由于体内高质量浓度的H2O2对酶促反应起到正调控的作用，此时接种植株抗病反应已被激活。接种7天后，QH-1处理组CAT活性大幅度下降，而其他处理组无明显变化，可能是因为QH-1处理组接种幼苗此时因ROS过量导致细胞损伤，进而无法继续产生CAT分解过量H2O2，这与SOD中的数据变化相似。后续致病力测定表明QH-1为强致病力松材线虫株系，说明通过早期CAT活性变化能够在一定程度上验证接种致病力强弱。本研究中，所有线虫处理组POD活性均呈先上升再下降的动态变化，接种1～3天内所有线虫处理组POD活性均高于对照组，之后开始呈下降趋势，表明此时接种植株抗病反应过度，导致POD活性下降。因此，在早期接种植株抗病过程中，通过CAT与POD活性测定能够在一定程度上反映后期发病程度，做到病害预测，减少经济损失。

当植物被病原物侵入时，寄主植物通过苯丙烷代谢途径抵御病害，此时PAL含量升高。当PAL活性升高后，其代谢产物的不断积累将会导致寄主植物的代谢紊乱，造成感病植株死亡(欧阳光察等， 1988)。陈玉惠等(2006)通过对1年半生马尾松植株进行松材线虫接种，并测定接种后植株防御酶活性，发现PAL活性高于对照，且活性高峰出现于外部病症表现前，并在感病后期下降。本研究中，所有线虫处理组在接种2天后，接种植株PAL活性均高于与CK组，与前人研究结果一致。接种7天后，所有处理组PAL活性均高于CK组，其中QH-1处理组与CK组相比活性上升幅度最大，且差异显著，表明强致病力株系与弱致病力株系相比，更能破坏接种红松内部生理活动，造成PAL活性升高。因此，通过测定早期PAL活性，更能反映感病松树的抗病反应程度。在本研究中，所有线虫处理组防御酶中，PAL活性变化幅度远大于其他防御酶，也说明在接种红松在发病初期，由PAL主导的生理生化反应响应最迅速，PAL活性变化幅度在一定程度上能够及时预测病原物对寄主致病力强弱。

3.2 株系差异对松材线虫致病力影响

不同株系松材线虫致病性强弱主要与松材线虫的地理来源、寄主植物、寄主树龄与饲喂菌株有一定关系(胡凯基等， 1994； 张治宇等， 2002； 杨宝君等， 1993； 瞿红叶等， 2009)。有研究发现，南方株系对黑松致病性强于北方株系，且北方株系对北方易感树种油松致病性大于南方株系(Kongetal., 2021)，与本研究致病性研究结果相似。本研究中所选松材线虫其地理来源与寄主植物分别为清原-红松(QH-1)、南京-马尾松(NM-1)与重庆-马尾松(CM-1)，因此本研究中不同株系松材线虫对4年生红松幼苗致病性存在差异，可能与地理分布与寄主植物有关。结合相关防御酶活性变化结果表明，4年生红松幼苗在接种强致病力松材线虫后，与接种弱致病力株系松材线虫的4年生红松幼苗相比，酶活性变化幅度更大。通过接种线虫并测定早期防御酶活性，可以预测接种松材线虫致病力强弱，至于其致病力差异的产生机制，有待进一步研究。

3.3 不同病原物对寄主御酶活性的影响

不同寄主病原物对寄主防御酶的活性影响存在一定差异。蔡丽等(2011)通过对橡胶(Heveabrasiliensis)树叶接种不同寄主来源的多主棒孢(Corynesporacassiicola)，发现接种叶片防御酶活性变化存在差异，且原寄主为橡胶树的多主棒孢更容易激发接种植株防御酶活性变化，变化幅度最高，其他寄主的多主棒孢侵染橡胶树后，酶活性升高幅度小。雍道敬等(2014)通过对苹果叶片分别接种2种不同致病性的苹果树腐烂病菌(Valsamalivar.mali)，发现接种强致病力菌株叶片防御酶活性变化幅度最早，但感病后期接种弱致病力菌株叶片防御酶活性峰值显著大于强致病力组，因此强致病力病原物能够加速寄主抗氧化反应失效，导致活性氧大量积累，加速寄主死亡，使得防御酶活性降低。本研究通过接种不同致病力松材线虫株系发现，强致病力株系QH-1导致4年生红松幼苗防御酶活性变化最早，变化幅度最大。接种7天后，QH-1处理组SOD、CAT与POD活性均低于弱致病力NM-1与CM-1处理组，与雍道敬等(2014)研究一致。接种35天后强致病力株系QH-1处理组线虫分离量显著大于其他处理组，这可能是因为QH-1株系线虫在早期侵入树体阶段，更早更快地破坏了接种幼苗树体内部抗氧化系统，进而能够大量繁殖。

4 结论

松材线虫株系QH-1、NM-1和CM-1对红松均有致病性，其中QH-1致病力最强，NM-1、CM-1无明显差异。防御酶活性结果表明，接种QH-1后的红松幼苗在发病早期SOD、CAT、POD与PAL变化幅度大于其他线虫处理组，且致病力强弱与防御酶活性变化幅度有一定相关性。综上所述，QH-1、NM-1与CM-1对4年生红松存在致病力差异，且致病力差异与寄主早期防御酶活性变化幅度有关。