生肌玉红膏对血栓性脉管炎大鼠血管平滑肌细胞凋亡、炎性因子表达的影响及机制

王亚娜，宋晓聪，吴静，崔罗方，刘丽，马文华，赵秀雷，徐林丽，南桂英，王慧玲

1沧州医学高等专科学校教研室，河北 沧州 061001；2沧州中心医院外科；3沧州医学高等专科学校内科护理教研室

血栓性静脉炎是浅表静脉的一种急性非化脓性炎症，常伴有继发性管腔内血栓形成，且由于供血不足，易致伤口愈合缓慢、疼痛剧烈难忍［1］。生肌玉红膏作为活血生肌的外用药物，具有化腐抗炎、消肿止痛的效用，并对疮毒及愈合困难溃疡、烧伤、烫伤等病症有良好治疗效果［2］。血管内皮祖细胞（EPC）为骨髓单个核细胞，能诱导分化为内皮细胞，在组织缺血、损伤、外源性细胞因子及药物刺激作用下，EPC可向血管受损部位聚集并参与到血管修复和新生血管形成［3］。由于EPC缺乏特征性血管腔样结构，仅从形态学特征上无法对其进行辨认，CD34、CD133是目前公认鉴定EPC表面分子的抗原组合［4］。血管平滑肌细胞的异常增殖是许多血管类疾病的共同病理基础。在高血压、动脉粥样硬化以及血管成形术后再狭窄等多种血管性疾病中，均伴随血管平滑肌细胞的异常增殖。2021年6月—8月，我们探究了生肌玉红膏联合EPC细胞对血栓性脉管炎大鼠血管平滑肌细胞凋亡及炎性因子表达的影响及机制。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料选取SPF级SD健康大44只，体质量120～220 g，由湖南中医药大学动物学部提供，使用许可证号：SCXK（湘）2020-0075，于室温15～25℃、每日光照12 h的室内饲养，湿度为45%～70%，喂养条件为标准饲料、自来水自由摄取，所有操作严格按照实验动物伦理委员会动物管理与使用指南执行。BS-124s型电子天平（北京赛多斯仪器系统有限公司），离心机（上海医用仪器厂），显微镜（重庆光学仪器厂），切片机（美国Bio-Rad公司），FACS Calibur流式细胞仪（桂林中辉科技发展有限公司），RIPA裂解液、上样缓冲液、BCA蛋白浓度测试试剂盒、一抗稀释液、二抗稀释液、辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG（重庆天圣制药有限公司），生肌玉红膏（广东达安生物基因有限公司），EPC（上海生物工程有限公司）。

1.2 分组及血栓性脉管炎模型制备根据Siegal推荐的神经功能判断六级分法进行评分后将大鼠分为正常组、模型组、生肌玉红膏组、EPC干预组，每组10只，除正常组外，均建立血栓性静脉炎动物模型。对大鼠进行腹腔内注射戊巴比妥钠麻醉，无菌条件下将大鼠左后肢进行脱毛处理，在腹股沟中点至膝内侧行手术切除直径为1.5 cm的皮肤组织，用止血钳夹破坏深筋膜，夹闭阻断血流，在钳夹后的肌纤维内皮下滴加松节油0.1 mL，包扎后分笼饲养，当肢体出现缺血性改变、坏死时则视为建模成功。44只大鼠随机选择34只建立动物模型，术后感染死亡4只，30只大鼠建模成功。

1.3 各组给药干预建模8 h后，正常组与模型组不进行干预，尾静脉输注生理盐水1 mL，每日1次，并进行伤口包扎固定处理；EPC干预组注射数量为5×105个EPC细胞后，采用创面外敷生肌玉红膏治疗，每次0.2 mg/0.5 cm2，涂于创伤局部后按摩15 min，每日1次；生肌玉红膏组给药依据文献［5］，具体组成：白芷25g，紫草10g，甘草60g，当归100g，血竭20g，轻粉20g，麻油10g，制成膏剂后涂于创伤表面，每日换药1次，均连续干预10 d。

1.4 EPC培养EPC用含有20%FBS的DMEM重悬细胞，接种于培养皿中，放入37℃培养箱中培养并观察，当细胞布满培养皿即可传代。传代时用含有0.25%胰酶、1 mmol/L EDTA和酚红的消化液，待镜下观察到细胞收缩、变圆，立即加入含20%FBS的DMEM终止消化，并用吸管将细胞吹打，按1∶2进行传代。3代后可改用10%FBS的DMEM培养。

1.5 血清炎性因子白细胞介素（IL）-6、IL-8、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、转化生长因子（TGF-β1）检测采用ELISA法。抽取大鼠尾部静脉血1.5 mL，3 000 r/min离心15 min（离心半径10 cm），取上清液，操作步骤严格按照试剂盒说明书进行，在400 nm波长处检测OD值，根据标准曲线和OD值计算IL-6、IL-8、TNF-α、TGF-β1的含量。计算公式：（对照OD值-测定OD值）×271倍×［1.0 mL÷（60 s×取样量）×样本测试前稀释倍数］。

1.6 组织形态观察组织提取：运用脊椎脱臼法处死大鼠，于无菌条件下剪开皮肤组织，取颈动脉血管组织约1.5 cm，放入生理盐水中进行剥离，采用6%多聚甲醛固定液固定，将载玻片、盖玻片清洁后放入烤箱烘干待用，脱水，将透明后的血管组织置于已溶化的石蜡中保温，后进行包埋，于切片机上每隔200µm切一张厚度为3µm的切片，恒温箱中烘干，将制备好的切片进行HE染色。HE染色：将组织进行石蜡包埋，置于10%甲醛溶液中，固定过夜，冲洗，浸于15%的EDTA溶液中脱钙，梯度脱水后石蜡包埋，4 µm切片备用，室温15 min，二苯甲脱蜡后按照100%、90%、80%及70%乙醇进行梯度脱水，苏木精染色15 min，1%盐酸处理，伊红复染，梯度乙醇脱水，封片后观察组织形态。

1.7 CD34、CD133表达检测采用免疫荧光法。将2%多聚甲醛固血管组织切片，进行PBS洗涤3次，5 min/次，加入5%PBS液，常温放置30 min，去除液体后加FITC标记的CD34、CD133抗体（2 mg/mL）各2µL于湿盒薄膜上，将盖玻片的贴壁细胞面盖在抗体稀释液上，避光作用2 h后用防粹灭剂中性树脂封片，选5个高倍视野，显微镜（×200）下观察，阳性细胞呈现绿色荧光和蓝色荧光，计算CD34、CD133。

1.8 平滑肌细胞凋亡率测算采用TUNEL法。将血管组织脱蜡及水化后，PBS溶液冲洗3次，每次5 min，取TUNEL反应液，恒温孵育2 h，将玻片置于PBS中在冲洗5 min×3次，浸入浓度为3%过氧化氢中10 min后用PBS溶液脱色，酶标反应后PBS洗15 min，置于DAB混合液出现浅棕色背景时采用去离子水反复冲洗3次，每次3 min，苏木素进行复染，用浓度为1%的乙醇分化，氨水反蓝后冲洗干净，将切片依次放入浓度为70%、80%乙醇和无水乙醇各脱水10 min，脱水透明3 min，树胶封片，显微镜下观察凋亡细胞呈棕黄色，切片在高倍镜下随机选10个视野，计算凋亡细胞数目及凋亡率，凋亡率=凋亡细胞总数/（凋亡细胞总数＋正常细胞总数）×100%。

1.9 内皮生长因子（VEGF）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）蛋白表达检测采用免疫印迹法。将血管组织进行胰蛋白酶消化及蛋白提取，加入SDS上样缓冲液，变性蛋白，加样，SDS-PAGE凝胶垂直电泳，电转移PVDF膜，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，加入一抗VEGF（1∶300）、bFGF（1∶500），室温孵1 h，5℃孵育过夜，加二抗羊抗兔IgG（1∶1 000），室温孵育1 h，ECL化学发光显影，以β-actin作为内参照，凝胶成像系统进行图像采集和分析，用Quantity One-v 4.6.2软件对显影条带进行分析，计算VEGF、bFGF蛋白相对表达量。

1.10 统计学方法采用SPSS20.0统计软件。计量资料符合正态分布以±s表示，多组间比较采用方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠血清中炎性因子IL-6、IL-8、TNF-α、TGF-β1水平比较模型组大鼠血清中IL-6、IL-8、TNF-α、TGF-β1水平高于正常组（P均＜0.05），EPC干预组以上指标低于模型组（P均＜0.05），生肌玉红膏组以上指标高于EPC干预组（P均＜0.05）。见表1。

表1 各组大鼠血清中炎性因子IL-6、IL-8、TNF-α、TGF-β1水平比较（±s）

表1 各组大鼠血清中炎性因子IL-6、IL-8、TNF-α、TGF-β1水平比较（±s）

注：与正常组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05；与EPC干预组比较，△P＜0.05。

组别正常组模型组EPC干预组生肌玉红膏组F P n 10 10 10 10 IL-6（ng/mL）16.15±2.19 142.06±8.56*41.25±4.57*#63.28±6.34*#△851.800＜0.05 IL-8（ng/mL）9.54±1.26 48.69±4.12*19.26±2.87*#30.11±3.83*#△271.600＜0.05 TNF-α（pg/mL）16.12±3.05 45.82±11.72*25.20±5.36*#36.56±8.34*#△215.360＜0.05 TGF-β1（pg/mL）9.20±1.36 28.69±8.56*15.21±4.15*#21.37±6.49*#△98.630＜0.05

2.2 各组组织形态观察正常组大鼠血管壁内膜完整无脱落现象，血管周围组织未出现炎性细胞浸润；模型组有明显血栓形成，多数血管壁结构消失和内膜脱落，血管平滑肌细胞排列紊乱，血管周围组织可见炎性细胞大量浸润；EPC干预组从管腔结构和内膜脱落情况来看，组织学变化明显缓解，极少量外周炎性细胞浸润，血管平滑肌细胞排列趋于整齐；生肌玉红膏组可见少量血栓和炎性细胞浸润，并伴有部分内膜脱落，血管平滑肌细胞排列略显紊乱。

2.3 各组大鼠血管组织中CD34、CD133表达比较模型组大鼠血管组织中CD34、CD133表达低于正常组（P均＜0.05），EPC干预组以上指标高于模型组（P均＜0.05），生肌玉红膏组CD34、CD133表达低于EPC干预组（P均＜0.05）。见表2。

表2 各组大鼠血管组织中CD34、CD133表达比较（%）

2.4 各组大鼠血管组织中平滑肌细胞凋亡率比较正常组、模型组、EPC干预组、生肌玉红膏组血管组织中平滑肌细胞凋亡率分别为（3.10±0.16）%、（19.80±2.10）%、（38.60±5.63）%、（23.70±3.45）%，与正常组比较，模型组血管组织中平滑肌细胞凋亡率升高（P＜0.05）；与模型组比较，EPC干预组血管组织中平滑肌细胞凋亡率升高（P＜0.05）；与EPC干预组比较，生肌玉红膏组平滑肌细胞凋亡率降低（P＜0.05）。

2.5 各组大鼠血管组织中VEGF、bFGF蛋白表达比较模型组血管组织中VEGF、bFGF蛋白表达低于正常组（P均＜0.05），EPC干预组VEGF、bFGF蛋白表达高于模型组，生肌玉红膏组VEGF、bFGF蛋白表达低于EPC干预组（P均＜0.05）。见表3。

表3 各组大鼠血管组织中VEGF、bFGF蛋白表达比较

3 讨论

血栓性静脉炎中医称之为“恶脉”或“脉痹”，多发生于下肢或盆腔内静脉区，临床老年人发病率较高，其病因与外伤或术后静脉壁损伤产生的血流滞缓增高、营血回流受阻等因素有关，最终导致患肢部位产生血滞、肿胀、疼痛等不良反应［6］。生肌玉红膏具有利湿消炎、化痛散结、通脉等功效。郭芳等［7］研究证实，生肌玉红膏对患处的抗炎、杀菌效果确切，对闭塞性脉管炎有良好治疗效果。EPC作为一种干细胞因子，在参与炎症反应过程中有较强的抗炎作用。

本研究结果显示，EPC干预组中IL-6、IL-8、TNF-α、TGF-β1表达低于模型组，提示生肌玉红膏通过介导EPC分化对降低炎性因子表达有积极作用。在血栓性静脉炎症早期，由于炎症细胞聚集释放IL-6、IL-8、TNF-α、TGF-β1等炎症因子，使炎症信号进一步放大导致炎性反应过度，促进血栓形成，降低炎症因子产生是治疗血栓性静脉炎的关键［8-9］。生肌玉红膏中的甘草、血竭等成分具有抗炎、清除氧自由基、增强免疫功能等作用。生肌玉红膏中的血竭和当归成分具有祛瘀消肿、活血通络之功效，而紫草具有清热凉血之功效，联用可发挥祛腐解毒、活血散瘀及生肌敛疮的效用。杨辉等［10］研究显示，生肌玉红膏在促进创面损伤修复及抗炎方面效果更佳，可抑制IL-6、TNF-α和IL-8等炎性因子表达，促进乳腺癌患者创面恢复。本研究结果与之相似，推测生肌玉红膏可能通过抑制炎症因子活性延缓血栓性静脉炎进展。

EPC作为一类能参与循环增殖并能分化为血管内皮细胞的干细胞，与早期造血干细胞及内皮细胞有相同前体。研究显示，CD34+EPC构成了内皮细胞的循环池，可在内皮细胞脱落或损伤时对受损血管进行修复，CD34、CD133的灵活变化反映了细胞活性，且血管内皮的自我修复能力随CD34、EPC降低而下降，代表血管内皮的修复能力变差，继而可能伴随血管病变、急性心脑血管以及靶器官损害等现象产生［11］。董智慧等［12］研究显示，当动脉血管出现直径变小或闭塞情况时会对肢体内血液循环造成影响，导致血栓性静脉炎中CD34、CD133表达降低。本研究中EPC干预组中的CD34、CD133表达高于模型组，提示生肌玉红膏可能通过提高CD34、CD133表达改善血栓性脉管炎大鼠的内皮功能。生肌玉红膏中的当归、紫草、白芷等，可明显促进疮疡愈合，全方共奏活血解毒、润肤生肌之功效。研究显示，生肌玉红膏对改善糖尿病足损伤引起的血管平滑肌强烈收缩和肢体血管持续痉挛导致的肢体缺血及血管内皮功能有良好修复作用［5］。由此推测，生肌玉红膏可能通过介导CD34、CD133参与内皮组织循环、增殖，参与生理性血管形成，减轻血管内皮炎性因子反应，进而在病理状态下增强代偿性血管重建能力和增强受损血管的修复能力，进而防止血栓性静脉炎的发生。

血栓性静脉炎的发生是平滑肌细胞增殖、凋亡、血管重构、血管炎症等多种复杂病理及生理过程。本研究中，EPC干预组的平滑肌细胞凋亡率高于模型组，提示生肌玉红膏可能通过介导EPC促进平滑肌细胞的凋亡。血栓性静脉炎的形成以平滑肌肌动蛋白的降低和细胞外基质胶原的过度沉积为特征，生肌玉红膏具有增强创面抗氧化机制，改善纤维功能，使毛细血管开放并增强血管通透性，增加平滑肌细胞的凋亡，降低病灶部位炎性反应，促进血栓性静脉炎的恢复［13］。

VEGF与bFGF具有促进创面愈合及血管再生、外周神经纤维再生和增强创面组织修复作用［13］。本研究中模型组血管组织中VEGF、bFGF蛋白表达低于正常组，EPC干预组的VEGF、bFGF蛋白表达高于模型组，生肌玉红膏组VEGF、bFGF蛋白表达低于EPC干预组，提示生肌玉红膏与EPC可能对VEGF、bFGF蛋白表达有一定影响。研究显示，血栓性静脉炎中的血管内噬细胞和内皮细胞分泌的VEGF、bFGF较低，而血管内通透性大的不完整基膜和容易破裂出血的新生毛细血管受到刺激后，血浆渗入血肿腔中，导致血栓性静脉炎创面不断增大［14］。生肌玉红膏中的甘草、白蜡等成分具有泻火解毒、助生新肌、调和诸药等功效，通过提高创面肉芽血红蛋白水平与羟脯氨酸含量，促进创面成纤维细胞生长和胶原合成的增加，进而加速受创皮肤的再生。陈盛业等［15］研究显示，生肌玉红膏可通过刺激血管内皮细胞增殖，使VEGF与bFGF在协同作用下对血管外膜产生刺激，加速细胞间物质代谢，通过增加bFGF促进创面胶原合成及上皮生长进而改善新生毛细血管和创面微循环状态，使创面愈合速度加快，降低血管内血栓形成及发展。本研究结果与之类似。

综上所述，生肌玉红膏可促进血栓性脉管炎大鼠的平滑肌细胞凋亡，降低炎性因子表达，激活VEGF与bFGF蛋白表达，发挥血管保护作用；其机制可能与介导EPC分化相关。