高效液相色谱法测定手冲咖啡中绿原酸与咖啡酸含量

袁栋勇，周湧智，毛玮琪，毕建辛，张黔文，纪晓娜，2*

（1.长春工程学院 理学院，长春 130012；2.吉林省城市污水处理重点实验室，长春 130012）

随着越来越多的人开始饮用咖啡，咖啡行业市场前景良好，咖啡的有效成分和安全性受到人们的关注。在咖啡豆烘焙过程中会产生各种各样的有机酸类物质[1]，包括绿原酸、咖啡酸和无水柠檬酸等30多种有机酸[2]，其中绿原酸不仅是咖啡豆中含量较高的风味物质，还具有很多生物功效，例如抗菌、抗氧化和抗肿瘤等；咖啡酸具有调血脂、抗氧化的作用。但如果人体饮用绿原酸、咖啡酸含量过多，也会对人体造成巨大的损害。根据CAS数据库显示[3]，绿原酸毒性很小，对小鼠半数致死量（LD50）大于1 g·kg-1，折算人体60 kg体重个体，半数致死量60 g；根据毒理学研究表示[4]，咖啡酸小鼠半数致死量（LD50）为4.85±0.47 g·kg-1，折算人体60 kg体重个体，半数致死量262.8～319.2 g。目前对咖啡豆的研究主要集中于加工方式对咖啡豆成分含量的影响[5-7]及功能研究等[8]，而探究不同产地咖啡豆制作手冲咖啡中的绿原酸和咖啡酸含量及手冲咖啡中绿原酸和咖啡酸含量的安全性研究则较少。为了进一步探究不同产地咖啡豆制作手冲咖啡中的绿原酸和咖啡酸含量及安全性问题，选取市面上常见的5种咖啡豆，采用高效液相色谱（HPLC）的方法检测这5种产地咖啡豆在手冲条件下绿原酸、咖啡酸2种风味物质含量。数据可用于分析手冲咖啡中的绿原酸和咖啡酸对人体是否安全。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂

甲醇、乙腈（色谱纯，山东禹王实业有限公司化工分公司）；乙酸（色谱纯，佛山西陇化工有限公司）。5种咖啡豆（长沙万物食品贸易有限公司）。绿原酸（色谱纯，上海源叶生物科技有限公司）；咖啡酸（色谱纯，上海安谱实验科技股份有限公司）。

1.2 主要仪器与设备

Agilent 1260高效液相色谱仪，Poroshell 120 ECC18型高效液相色谱柱（美国安捷伦公司）；手摇磨豆机；针式滤膜（0.45 μm，上海安谱实验科技股份有限公司）。

1.3 试验条件

1.3.1 色谱条件[9]

流动相A：0.5%乙酸水溶液；流动相B：乙腈。V（A）∶V（B）=95∶5，流速：1 mL·min-1；进样量10 μL；柱温：35℃；多波长紫外检测器，波长：285 nm[10]。

1.3.2 标准品溶液的配制

精密称取绿原酸标准品和咖啡酸标准品20.0 mg，分别移至10 mL容量瓶和50 mL容量瓶中，并用超纯水定容，得到标准母液绿原酸（2 000 mg·L-1）和咖啡酸（400 mg·L-1）。

1.3.3 标准品标准梯度溶液的配制

以超纯水稀释定容至10 mL，得到1.0、5.0、10.0、25.0、50.0、100.0、200.0、300.0 mg·L-1的绿原酸和1.0、2.5、5.0、10.0、20.0、30.0、40.0、50.0 mg·L-1的咖啡酸系列标准溶液，均稀释10倍待测。

1.3.4 样品前处理方法

用手摇磨豆机将咖啡豆打碎，杨青山等[11]研究表明，将不同咖啡豆粉碎至40目、通过率80%以上细度，每次磨碎后多次清洗磨豆机，保证下一次无杂质出现，将筛上物和筛下物混合均匀后，作为待测咖啡豆。分别取5种地区的待测咖啡豆，分别准确称取9.000 g置于咖啡滤纸中，加入200.0 mL 95℃的超纯水，匀速搅拌使咖啡中的物质更好地溶解，冷却后取样，分别取0.100 mL溶解液，定容于2 mL样品瓶中，定容（稀释10倍）过0.45 μm滤膜，置于另一样品瓶中，待测。

2 结果与分析

2.1 定性和定量分析

利用保留时间（tR）定性分析，将1.3.4中的标准品标准梯度溶液进行检测，以标准品浓度（c）为X轴，以峰面积（A）为Y轴，得到绿原酸和咖啡酸的梯度工作曲线，采用外标法定量分析，结果见表1。

表1 定性和定量分析相关数据

2.2 5种手冲咖啡样品的检测

将1.3.4的待测液分别进行HPLC检测，以中国云南省小粒咖啡为例，色谱图如图1所示。5种产地咖啡豆制作的手冲咖啡中绿原酸和咖啡酸结果见表2。

表2 5种手冲咖啡中绿原酸和咖啡酸的检测数据

图1 中国云南省小粒手冲咖啡的高效液相色谱图

2.3 精密度检验

对5种产地咖啡做7次平行测试，得到绿原酸的平均质量浓度、标准偏差（S）和相对标准偏差（见表3）。

表3 绿原酸测量数据表

2.4 加标回收试验

取巴布亚新几内亚拉玛莉水样，按照以下条件对水样进行3次水平加标回收试验，结果见表4。实验测得绿原酸的加标回收率为83.6%～96.0%，咖啡酸的加标回收率为92.4%～95.8%，说明检测方法可靠。

表4 加标回收率

2.5 最低检出限

将含有已知浓度的绿原酸和咖啡酸的标准溶液多次稀释至0.007 mg·L-1和0.004 mg·L-1，信噪比（S/N）分别为2.58和3.37（在2～5的范围内）。确定最低检出限为绿原酸0.007 mg·L-1和咖啡酸0.004 mg·L-1。

3 结论

综上所述，5种不同产地咖啡豆手冲咖啡中的绿原酸大致含量分别为1.943、3.097、1.334、1.940和2.542 g·kg-1。中国云南省小粒咖啡豆手冲咖啡中咖啡酸含量为0.020 g·kg-1，其余咖啡豆制作的手冲咖啡中咖啡酸未检出。本试验方法经精密度、加标回收率和最低检出限等试验验证，其相对标准偏差均在规定的误差范围内，说明该处理方法及色谱条件适用于手冲咖啡咖啡豆中绿原酸和咖啡酸的定量分析，方法准确可行。

同时，根据绿原酸和咖啡酸对人体的半数致死量，可以估算出以上5种手冲咖啡的人体最大饮用量范围为19.37～44.98 kg；中国云南省小粒咖啡的人体最大饮用量为13 100 kg。结合人体日常服用咖啡量，可以得出人体日常饮用手冲咖啡对人体无害。

综上所述，本试验确定了一种简单、快速并能准确测定手冲咖啡中绿原酸和咖啡酸含量的高效液相色谱方法。同时，通过分析，人体日常饮用手冲咖啡中的绿原酸和咖啡酸对人体无害，为咖啡豆质量安全的评定提供了可行的参考方法。