线粒体功能障碍与慢性肾衰竭肾间质纤维化的关系

王艳文,李小会,陈丽名,屈 杰

(1. 陕西中医药大学附属医院，陕西 咸阳 712000；2. 陕西中医药大学，陕西 咸阳 712046)

慢性肾衰竭(chronic renal failure,CRF)是各种慢性肾脏疾病(CKD)持续进展至后期的共同结局,疾病发展过程中可见肾脏病理形态及功能的损害。肾间质纤维化是CRF发生、发展过程中的主要病理改变,是疾病进展至终末期肾脏病(ESRD)的共同通路,其进展情况直接影响CRF病情程度。CKD消耗能量多,随病情渐进性发展，肾单位不断遭到破坏,肾脏固有细胞(PTC)凋亡增多,需要足够的三磷酸腺苷(ATP)来维持机体正常的运转。线粒体是细胞合成ATP的场所,当其功能出现障碍时，ATP合成不足,同时生成过量的氧自由基,释放大量炎症因子,这些均会伴随CRF的发病过程,并促使CRF进展至ESRD。研究发现，线粒体功能障碍能够介导肾小管上皮细胞的上皮间充质转化(EMT)[1]；保护线粒体功能可以有效缓解5/6肾切除模型中的肾间质纤维化[2]。此外，模式识别受体家族成员NLRP3的表达下调可减轻线粒体功能障碍并进一步缓解CRF肾脏纤维化[3]。过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)能够介导多种细胞线粒体生物合成及氧化磷酸化过程,其激动剂能减轻肾间质纤维化和炎症反应。以上均说明线粒体功能障碍可能与肾间质纤维化关系密切。目前,CRF的治疗主要是减少危害肾功能的相关因素，保护残存肾单位，延缓病情进展，但临床预后欠佳，随着CRF患病人数的增加，急需寻找可靠的治疗新靶点对CRF进行有效防控。因此,本文就线粒体功能障碍与CRF肾间质纤维化的关系进行综述,以期找到新的干预靶点，以抗纤维化并延缓CRF的进展,提高临床治疗效果。

1 线粒体及其功能概述

线粒体是真核细胞胞浆中由双层磷脂膜包被的细胞器，是细胞进行氧化磷酸化、合成ATP的主要场所。线粒体膜与膜间腔内含有大量参与细胞代谢的酶以及少量线粒体DNA，其产生ATP主要是依靠内膜上的多亚基复合体即电子传递链来完成。线粒体合成ATP的途径主要是依靠脂肪酸、葡萄糖和氨基酸的代谢产物,经三羧酸循环和氧化磷酸化过程,产生足够的能量以满足机体各组织器官的需求；除了产生能量,线粒体还可以控制Ca2+的储存和释放以维持细胞内Ca2+浓度的动态平衡,并在活性氧(reactive oxygen species,ROS)的产生和清除、诱导炎症反应、参与细胞生长及细胞基质代谢、调控细胞凋亡、启动信号转导通路等方面发挥重要作用[4-5]。ROS是线粒体氧化磷酸化过程中的副产物,能够参与信号转导、调节代谢等过程，并与线粒体功能障碍的发生密切相关。

线粒体是真核细胞中的能量工厂,是机体能量代谢的中心，并参与多种病理生理反应。CRF发展过程中持续受到水、电解质代谢紊乱和酸碱平衡失调等因素的影响,而线粒体又极敏感,其结构和功能受体液环境的刺激最易出现失常。当细胞被损伤所刺激时,线粒体膜流动性减慢,膜电位变低,继而线粒体产能发生障碍,ATP合成减少,出现各器官能量供应匮乏。体内90%的ROS来源于线粒体,氧化磷酸化时会改变电子传递方向,电子被传递给ROS产物，增加了氧化应激，而线粒体又是最易因氧化应激受损的靶细胞器。线粒体一旦因各种病理因素发生功能障碍，大量产生的ROS反过来会攻击线粒体而使其损伤加剧。ROS也是线粒体DNA(mtDNA)受损的主要原因，ROS会对mtDNA产生氧化损伤,mtDNA缺乏组蛋白的保护,又无损伤修复系统,氧化损伤后无法修复。ROS还会损害线粒体的酶类、脂类和核酸,致使ROS生成更多,进一步使线粒体膜通透性转变孔的开关改变,造成细胞凋亡和坏死,说明体内线粒体源性ROS增多是线粒体发生功能障碍的主要表现之一。总之，线粒体出现功能障碍后会降低呼吸链酶活性,降低线粒体膜电位,使ATP合成不足；线粒体DNA复制数量减少以及促凋亡因子细胞色素C从线粒体到细胞质内的释放,细胞内钙稳态失衡,线粒体通透性发生转变及脂肪酸氧化受阻而蓄积在细胞内,增加氧化应激；mtDNA氧化损伤又减少了线粒体生物合成,线粒体功能障碍进而加剧,最终出现细胞凋亡或死亡。

2 肾间质纤维化

在CKD进展过程中，纤维化是导致肾功能进行性丧失的关键因素之一。肾间质纤维化主要表现为肾小管萎缩、炎症细胞的浸润、增生的成纤维细胞、细胞外基质(ECM)的沉积、瘢痕组织替代正常肾脏组织[6]。研究表明,肾间质纤维化的发生是多种致病因素持续作用的结果，如细胞会出现损伤及活化，产生促炎因子及致纤维化因子，促使纤维化形成，进一步导致肾脏结构改变及功能的衰退,并可见到聚集的小管基底膜成分和间质细胞外基质以及大量繁殖的α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)阳性肌成纤维细胞[7]。肌成纤维细胞是由肾小管上皮细胞经过EMT所产生,继而间质区ECM大量产生和沉积,破坏了正常肾组织的细胞外基质稳态平衡,促使上皮细胞发生凋亡、肾小管萎缩,最终形成瘢痕组织及导致纤维化的发生[6]。

2.1EMT与肾间质纤维化 肾间质纤维化发病机制复杂,受多种因素影响。EMT是肾间质纤维化发病机制的核心环节，是活化的肌成纤维细胞的关键来源之一[8]。E-钙黏蛋白(E-cadherin)是上皮细胞的特异性标志物，主要负责细胞之间的黏附。上皮细胞向间充质细胞转化的第一步也是关键步骤，即E-钙黏蛋白的下调,导致上皮细胞不能与其他细胞正常黏附,继而α-SMA表达和肌动蛋白重组、基底膜遭到破坏,最后为能顺利进行转变,新的间充质细胞会激活α-SMA、胶原蛋白、波形蛋白和成纤维细胞特异性蛋白1的表达[9]。结缔组织生长因子(CTGF)是一种促纤维化因子,能够与表皮生长因子受体(EGFR)结合,进而参与成纤维细胞细胞外基质的合成，并诱发肾小管上皮细胞的EMT,推动肾间质纤维化进展[10-11]。肾小管EMT在肾间质纤维化发病机制中占据重要作用，其能够诱导肌成纤维细胞的分化，促进炎症信号转导;EMT由多种细胞因子及信号转导通路共同调控，其发生主要责于调控失衡导致ECM合成和降解失调进一步过度积聚所致[12]。

2.2转化生长因子-β1与肾间质纤维化 转化生长因子-β1(TGF-β1)是致纤维化因子中最关键的细胞因子,可诱导肾小管上皮细胞发生EMT,加快肾间质纤维化的进展[8]。TGF-β1是强效的诱导剂,在间充质基因表达过程中发挥重要作用，能够促使肾小管上皮细胞向间充质细胞转化,进而增加间充质细胞标志蛋白α-SMA的表达，减少上皮细胞标志蛋白E-cadherin的表达[13]。TGF-β1会使ECM合成和降解失衡，通过加快ECM受体-整合素的合成,使细胞基质间的相互作用增强,抑制基质金属蛋白酶表达而促进其抑制剂表达，减少ECM的降解[12]；还能通过Smad蛋白、蛋白激酶B等信号通路增加ECM的生成,促进EMT的发生。此外,TGF-β1还能调节小管上皮细胞、内皮细胞的凋亡,使血小板衍生生长因子、血管紧张素Ⅱ的表达上调,诱导成纤维细胞转化为肌成纤维,进而发生上皮细胞转分化,加快肾间质纤维化的进展[6]。

2.3NLRP3炎症小体与肾间质纤维化 CRF进展过程中,肾脏的排泄、内分泌及代谢等功能发生紊乱，加之体内毒素的蓄积，均会引起炎性细胞因子的聚集。NOD样受体蛋白3(NLRP3)炎症小体可被多种刺激原激活,引起促炎症因子的释放增多,加重肾组织的炎症反应,进一步促进CRF的进展。NLRP3蛋白被激活后发生寡聚化，并与衔接蛋白凋亡相关的斑点样蛋白共同形成炎症小体,诱导白细胞介素(IL)-1β、IL-18前体转化为具有活性的IL-1β、IL-18,促使纤维化的发生[14-15]。近年来,众多体内外研究证明，肾脏炎症发生发展的细胞学机制之一是由NLRP3炎症小体活化所介导,阻断其活化可明显缓解模型动物肾脏炎症及损伤。Vilaysane等[16]发现,单侧输尿管梗阻的小鼠模型中,NLRP3炎症小体活化后会使肾脏纤维化加重；而在晶体型肾损伤模型中,经NLRP3炎症小体特异性抑制剂CP-456干预后，肾脏的炎症反应及纤维化程度明显减轻[17]。Chi等[18]发现IL-36敲除通过抑制NLRP3炎症小体活化从而减轻单侧输尿管梗阻引起的肾脏炎症和纤维化。Foresto-Neto等[19]发现别嘌醇可改善5/6肾切除大鼠体内尿酸水平,抑制NLRP3炎症小体活化,使大鼠肾小管间质纤维化得到明显缓解。Wang等[20]发现,NLRP3炎症小体能激活TGF-β通路,使下游Smad相关蛋白的表达增加,进一步导致肾脏纤维化加重；而TGF-β又能介导Smad3途径活化NLRP3炎症小体,其中Smad2和Smad3磷酸化的必要条件即NLRP3和ASC的活化。Tanino等[21]发现,CKD小鼠的肾小管上皮细胞中IL-18表达明显升高,给予IL-18抗体处理后，UUO小鼠肾脏损伤及纤维化程度得到缓解,表明NLRP3炎症小体下游的炎症因子(IL-1β、IL-18等)在肾小管间质炎症的发生发展中起到重要作用。

2.4PPARγ与肾间质纤维化 PPARγ是核细胞受体家族的三个亚型(α、β、γ)之一，其主要在肾脏中发挥作用。PPARγ能调节肾脏的发育及脂质代谢,调控水钠的重吸收及肾血流量，并能使肾素-血管紧张素系统激活[22]；还具有调节抗氧化酶、抗氧化应激、抗细胞增殖、炎症反应和组织纤维化等作用；其激动剂能保护肾脏,减轻肾脏细胞的损伤,缓解肾脏炎症反应和纤维化[23]。Lu等[24]发现，PPARγ的激活在改善RIF的发展和治疗CKD方面具有潜在的价值。已有研究表明,高糖刺激后,能够明显下调PPARγ在肾小管上皮细胞中的表达,降低E-cadherin表达,而增加α-SMA和胶原蛋白-Ⅲ表达,诱使PTC发生EMT,引起细胞增殖和细胞外基质的产生[25]。PPARγ激动后能有效减轻单侧输尿管结扎(UUO)模型中的RIF程度，表明PPARγ激动剂能减轻RIF和炎症反应[26]。Panchapakesan等[27]发现，PPARγ激动剂能限制近端小管的促炎症反应，早期应用能限制糖尿病肾病的发展。GW9662是一种PPARγ阻断剂,能够显著上调体外培养的多囊肾细胞中的TGF-β1,并诱导胶原和纤连蛋白积聚。此外,GW9662显著增加UUO小鼠肾组织中TGF-β1的表达, 从而显著加重肾间质损伤和纤维化[28]。

3 线粒体功能障碍与肾间质纤维化

3.1线粒体功能障碍与EMT 众多研究表明,线粒体功能障碍是肾小管上皮细胞损伤的主要特征,在肾脏损伤持续进展过程中发挥重要作用[29-30]。并有研究显示，阻断线粒体功能障碍后,能够缓解被醛固酮刺激所导致的足细胞损伤及蛋白尿的产生，同样，在梗阻性肾病发病过程中,肾脏纤维化及炎症反应也得到有效减轻[31]。肾小管EMT即小管上皮细胞失去表型后,进一步转化为成纤维细胞,肾脏纤维化发生过程中,约有36%的成纤维细胞是由局部EMT转化而来,表明EMT在肾间质纤维化进展中发挥重要作用。研究发现，应用醛固酮处理近端小管上皮细胞后,细胞内线粒体ROS产生增多，EMT发生增加,给予鱼藤酮(线粒体呼吸链复合物Ⅰ抑制剂)干预后,EMT进展和ROS生成均得到改善，说明线粒体功能障碍能够影响肾间质纤维化进程[32]。Yuan等[33]研究发现,醛固酮能抑制线粒体功能调节因子过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子-α(PGC-1α)的表达,引发线粒体出现功能障碍，如膜电位降低、mtDNA破坏等,进而诱导EMT的发生,应用盐皮质激素受体阻滞剂处理后，线粒体功能障碍得到减轻。张佳欣等[34]研究发现,线粒体生物合成在TGF-β1诱导EMT发生的过程中也受到抑制,造成ATP产生减少，不能满足细胞能量需求,这或许会促进EMT的发生。EMT发生过程中,TGF-β1的干预引发了线粒体生物合成及功能障碍,促使ROS产生增多,说明线粒体在EMT发生中发挥关键的调节作用,具体可能与线粒体ROS有关。

3.2线粒体功能障碍与TGF-β1TGF-β1在CKD发生、发展过程中也发挥关键作用,能够通过多种途径干预CKD的进展,并与线粒体功能障碍及肾间质纤维化密切相关，主要表现为四个方面:①诱导近端肾小管上皮细胞内的线粒体发生裂解,引起小管上皮细胞凋亡；②促进肾小管EMT的发生,引发肾间质纤维化；③诱使细胞外基质异常堆积,肾小球基底膜厚度增加,肾间质纤维化程度加重；④诱导细胞内线粒体生成ROS增多,Smad3的表达受到刺激,纤维化相关因子的基因表达增加,推动肾脏纤维化进程[35-36]。TGF-β1能够促使人肾小管上皮细胞(HK-2细胞)发生EMT,线粒体ROS在TGF-β1诱导EMT的信号通路中起到作用。线粒体ROS介导了醛固酮诱导的HK-2细胞发生EMT,由于mtDNA与相关蛋白会被电子传递链过程中产生的氧自由基破坏,加之脂质过氧化以及线粒体渗透性转换孔的打开,引发线粒体功能障碍,推动EMT的发生。HK-2细胞发生EMT后，线粒体融合蛋白2(Mfn2)表达也受到影响,说明Mfn2及线粒体功能与肾间质纤维化的发展相关[8]。MnTBAP具有抗自由基氧化损伤作用,能够改善线粒体功能[37]。Yu等[38]应用MnTBAP预处理阻断TGF-β1诱导的肾脏固有细胞EMT和线粒体功能障碍，发现MnTBAP预处理能够减轻PTC线粒体功能障碍相关指标的变化，如ROS、线粒体膜电位、mtDNA,并改善TGF-β1诱导的E-cadherin表达减少、α-SMA表达增加，提示阻断线粒体功能障碍能够缓解TGF-β1所诱导的PTC损伤。又进一步对5/6肾切除小鼠应用抗氧化剂MnTBAP腹腔注射,研究阻断线粒体功能障碍对CRF小鼠肾间质纤维化的影响，发现MnTBAP能够抑制CRF小鼠肾脏纤维化,减少尿蛋白。以上结果提示线粒体功能障碍参与了5/6肾切除诱导的小鼠CRF肾间质纤维化以及TGF-β1所诱导的肾脏固有细胞EMT,抑制线粒体功能障碍能够缓解CRF肾损伤。此外,MnTBAP还能抑制梗阻性损伤所诱导的线粒体功能障碍,可改善水通道蛋白AQP1、AQP2、AQP3和AQP4等的表达,缓解肾组织炎症和纤维化[39]。因此,靶向线粒体氧化应激可能是延缓慢性肾脏病肾纤维化和疾病进展的有效策略。

3.3线粒体功能障碍与NLRP3 有报道显示[40]，NLRP3炎症体的激活使蛋白尿肾病中肾小管线粒体功能障碍加重。NLRP3炎症小体活化与线粒体受损及自噬有关。线粒体功能障碍能激活NLRP3炎症小体,诱导组织发生炎症反应。理论上，炎症可引起线粒体损伤，导致线粒体产生氧化应激和凋亡，而线粒体功能障碍也会促进炎症的发生和进展，从而形成炎症与线粒体功能紊乱之间的正反馈回路。近年,调控NLRP3炎症小体的中心一直被认为是线粒体来源的ROS[41]。线粒体出现功能障碍时,会生成大量的ROS,机体不能及时清除,聚集的ROS会进一步使相关的信号通路被激活而导致细胞受损[42]。线粒体持续产生细胞活性氧，在细胞应激期间，ROS的水平会显著增加，其进入胞质后可活化NLRP3炎性体。研究显示,线粒体靶向抗氧化剂抑制ROS的生成后,肾小管上皮细胞NLRP3炎症小体的激活也受到抑制,细胞损伤得到减轻[43]。此外，线粒体发生功能障碍时,释放至胞质的mtDNA会形成损伤相关分子模式，可直接活化NLRP3炎症小体并与其结合,调控下游炎性因子IL-1β等的合成和分泌,调节炎症反应和组织损伤[44]。线粒体自噬是通过清除受损、功能异常的线粒体，降低细胞内ROS，从而减少NLRP3炎性小体活化。研究显示,在巨噬细胞中，敲除自噬基因ATG16L1或ATG7后,会增加IL-1β的表达,而IL-1β的成熟与释放主要依靠NLRP3炎症小体活化,提示自噬会干预NLRP3炎症小体的活化[42]。将自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤作为自噬阻断剂添加进体外培养的腹膜间皮细胞中，干预自噬过程中发挥关键作用的蛋白(Beclin1干预小RNA、ATG5干预小RNA)后,发现损伤的线粒体增加，ROS产生增多,IL-1β表达水平显著提高,再经白藜芦醇促进细胞发生自噬后,NLRP3炎症小体被激活，但其上调IL-1β表达的效应明显减弱[44]。可见,阻止自噬发生后，细胞内会出现受损及功能障碍的线粒体堆积，进而释放过多的ROS，促使NLRP3炎症小体被激活；而适度自噬会保持线粒体功能的正常,并减少NLRP3炎症小体的激活。

3.4线粒体功能障碍与PPARγ PPARγ拥有很强的抗炎、抗氧化、调节氧化代谢能力,能参与多种细胞线粒体生物合成并调节氧化磷酸化过程,而ROS生成、氧化应激是线粒体功能障碍的主要表现。PPARγ发生突变时会增加细胞内ROS的表达,降低线粒体膜电位,线粒体功能正常的维持需要依靠PPARγ的高表达[45]；PPARγ又能减少ROS的生成,促进内皮型一氧化氮合酶磷酸化并增加一氧化氮的产量。另外,人工合成的PPARγ激动剂-噻唑烷二酮类药物(罗格列酮等),已被广泛用于临床治疗2型糖尿病,并被证明通过抑制线粒体功能障碍能对部分神经性病变的治疗发挥潜在价值[46]。PPARγ激动剂也被证明能保护肾脏,减轻蛋白尿、改善肾纤维化,而这与抑制线粒体氧化应激有关[47]。在小鼠成纤维细胞中,增加PPARγ表达会升高线粒体膜电位。在血管内皮细胞中,PPARγ通过抑制线粒体膜电位下降而维持线粒体功能正常。另外,PPARγ亦能调控线粒体合成ATP及mtDNA的拷贝数[48]。PPARγ过表达能够抑制TGF-β1诱导的PTC线粒体发生功能障碍,通过逆转线粒体膜电位降低及mtDNA拷贝数减少,缓解PTC损伤。因此,作为线粒体功能调控者的PPARγ,有望成为潜在的治疗靶点以改善PTC损伤。

4 小 结

近年来,CRF的临床治疗虽已取得良好的进展,但仍无特效药物或合理的干预措施对CRF患者进行根治性治疗,伴随肾间质纤维化的进展,最终发展为ESRD。肾间质纤维化发生机制复杂,由多个环节相互作用、相互调节,其最主要的病理变化是肾间质纤维细胞增生和ECM积聚，最终会导致肾脏功能丧失,延缓或阻止肾间质纤维化的产生及进展可有效减少ESRD的出现。目前临床上主要通过控制加剧肾功能恶化的危险因素来防治肾脏纤维化,一旦纤维化进展导致PTC少于10%,肾脏功能严重受损,患者只能接受肾脏移植或透析治疗。因此,缓解肾脏组织的持续性损伤,改善肾功能,关键是要阻止肾脏纤维化的发生、发展。线粒体功能障碍伴随多种慢性肾脏疾病的发生发展,通过对线粒体功能障碍与CRF肾间质纤维化的相关机制进行研究,发现其参与了肾间质纤维化发生过程中的关键机制,如EMT的发生、致纤维化因子TGF-β1相关通路、NLRP3炎症小体活化、PPARγ的表达,线粒体功能障碍与RIF相关机制之间相互影响,相互调控。因此,或许能够通过阻断线粒体功能障碍以减轻或抑制肾间质纤维化的发生，缓解CRF患者病情，但具体干预方法有待进一步深入研究。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。