抗生素对不同土壤中酶活性的影响

周椿富，于锐，王翔，闯绍闯，杨洪杏，谢越

安徽科技学院资源与环境院，安徽 凤阳 233100

抗生素是由某些微生物产生或通过人工合成的，能够起到抑制微生物和其他细胞增殖作用的一类化学物质（顾觉奋，2002；刘文英，2003）。由于可以促进动物生长和预防疾病（Baran et al.，2011；Liao et al.，2016），故作为饲料添加剂在畜禽养殖行业中广泛应用，全球每年抗生素使用量约为10—20万吨，其中70%用于畜牧业（Van et al.，2015；Qian et al.，2017；陈俊辉，2010；隋倩雯等，2015）。经人体或动物摄入的抗生素中 85%会以原形或代谢产物的形式排入环境且仍具有生物活性，并能转化形成代谢物母体（Amorim et al.，2014；Topal et al.，2016；王冉等，2006）。土霉素（Oxytetracycline，OTC）等四环素类、恩诺沙星（Enrofloxacin，ENR）等第三代氟喹诺酮类、磺胺二甲嘧啶（Sulfamethazine，SM2）等磺胺类药物因其具有广谱高效的特点，当前在我国生产量最大，使用量最多，在畜禽养殖行业中广泛应用（Yang et al.，2010；杜黎明等，2006；金彩霞等，2010；魏子艳等，2014），其在使用中产生的环境问题也备受关注。当前抗生素滥用造成严重的环境问题，土壤和水体中均检测到大量抗生素残留，其带来的环境污染问题已成为研究热点（Zhu et al.，2013；Qin et al.，2019）。

土壤酶是土壤的重要成分，参与土壤中所有复杂的生化过程，对土壤中营养物质转化、养分固定与释放起关键作用，与土壤供肥能力紧密相关，是目前评价土壤肥力的重要指标（刘超等，2019；陆琴等，2020）。张昊等（2012）在土霉素暴露对小麦根际抗生素抗性细菌及土壤酶活性的影响研究中发现，土壤磷酸酶、脱氢酶等活性在土霉素暴露环境中均有所下降。金兰淑等（2013）研究表明，不同浓度四环素对土壤脲酶和土壤磷酸酶活性影响表现出差异，低浓度四环素促进土壤两种酶活性，高浓度四环素抑制两种土壤酶活性。闫赛红（2015）在研究中发现，恩诺沙星单一污染在第14天对蔗糖酶活性具有促进作用，而第7、21、28天表现为抑制作用。张晨等（2018）研究了典型磺胺类抗生素对土壤酶活性的影响，结果表明磺胺甲恶唑和磺胺甲基嘧啶对土壤脱氢酶和过氧化氢酶活性产生抑制作用，而磺胺甲基嘧啶和磺胺噻唑对土壤脱氢酶及过氧化氢酶活性呈现诱导作用。然而，目前抗生素在不同类型土壤中对土壤酶活性的影响尚未见报道。通过开展抗生素对酸性、中性和碱性土壤中土壤酶活影响的研究，分析抗生素对土壤酶活性的影响，明确抗生素与土壤酶两者间的关系。

因此，本研究以酸性、中性和碱性土壤为研究对象，通过添加土霉素、恩诺沙星和磺胺二甲嘧啶进行处理，分析土壤中脲酶、过氧化氢酶和磷酸酶活性的变化情况，旨在揭示在抗生素残留背景下农田土壤的生态系统功能稳定性，以期为抗生素污染农田土壤的恢复工作提供数据支持和科学依据。

1 材料与方法

1.1 样本采集与处理

实验土壤取自安徽省黄山市黄山区汤口镇农田（30°07′N，118°18′E，pH 为 5.8），安徽省滁州市凤阳县安徽科技学院九华山试验田（32°87′N，117°57′E，pH为7.1），安徽省滁州市凤阳县黄湾村水稻田（32°98′N，117°72′E，pH 为 7.6）。以五点取样法采集距地表5—15 cm处土壤，在阴凉处风干后研磨过0.425 mm筛。

1.2 试验设计

试验设不同pH土壤（Ac：酸性、Ne：中性、Al：碱性），分别添加不同抗生素（CK：不添加抗生素、OTC：添加土霉素、ENR：添加恩诺沙星、SM2：添加磺胺二甲嘧啶），抗生素添加量见表1，共12个处理，每个处理3次重复。分别将500 g供试土样分装至盆钵中，每盆土样添加抗生素后用蒸馏水完全润湿并混匀，置于恒温箱中培养28 d，培养期间保持土壤湿润，采集0、7、14、21、28 d样品于负20 ℃保存，用于检测分析。

表1 不同土壤处理下的抗生素添加量Table 1 Antibiotic addition under different soil treatments

1.3 土壤酶的测定方法

各土壤酶活性参照关松荫（1986）方法测定，脲酶活性采用苯酚钠次氯酸钠比色法测定，将10 g土样与2 mL甲苯混合静止15 min，加10 mL尿素溶液和20 mL柠檬酸盐缓冲液混匀，37 ℃培养24 h后定容至100 mL，取1 mL滤液显色后在578 nm下比色，最终以 g·kg-1（37 ℃，24 h）表示。磷酸酶活性采用磷酸苯二钠比色法，将1 g土样加入50 mL锥形瓶中，添加0.2 mL甲苯、4 mL缓冲液、1 mL 0.05 moL·L-1对硝基苯磷酸二钠溶液，混匀后37 ℃下培养1 h，显色后在410 nm下比色，最终以g·kg-1（37 ℃，24 h）表示。过氧化氢酶活性采用高锰酸钾滴定法测定，将3 g土样加入150 mL锥形瓶中，添加40 mL蒸馏水和5 mL的0.3% H2O2混匀，震荡20 min后添加5 mL的3.0 mol·L-1H2SO4，过滤后取25 mL滤液用0.1 mol·L-1KMnO4滴定至淡粉红色，最终过氧化氢酶活性由单位干土消耗的 0.1 mol·L-1KMnO4含量计，以 g·kg-1（37 ℃，20 min）表示。

1.4 数据处理与分析

实验数据应用Microsoft Excel 2010软件计算平均值及标准偏差，应用SPSS 22.0软件进行单因素方差分析（one-way ANOVA）和Duncan氏多重比较检验，应用Origin 2022软件进行图件绘制。

2 结果与分析

2.1 抗生素对酸性土壤中土壤酶活性的影响

施加抗生素对酸性土壤中土壤酶活性的影响如图 1。各试验组酸性土壤中脲酶活性较对照组均显著受到抑制，其中 SM2对酸性土壤中脲酶活性抑制程度最高，与对照组相比OTC、ENR和SM2对脲酶活性最高抑制率分别达 38.03%、74.31%和84.13%（图1a）。添加OTC对酸性土壤中过氧化氢酶活性有先抑制后促进的作用，最高抑制率和促进率分别为41.43%和222.99%，添加ENR和SM2对酸性土壤中过氧化氢酶活性具有显著促进作用，最高促进率分别为24.88%和268.25%（图1b）。添加OTC对酸性土壤中磷酸酶活性具有先抑制后促进的作用，最高抑制率和促进率分别为 37.90%和71.63%；添加 ENR、SM2后对土壤中磷酸酶活性具有显著促进作用，最高促进率分别为 43.72%和51.21%，但分别在21 d和7 d后促进效果减弱并逐步抑制，其中添加ENR第28天磷酸酶活性与对照组基本持平，而添加SM2第21天后磷酸酶活性显著降低，最大抑制率为76.28%（图1c）。

图1 抗生素对酸性土壤中酶活性的影响Figure 1 Effect of antibiotics on enzyme activity in acid soil

2.2 抗生素对中性土壤中土壤酶活性的影响

施加抗生素对中性土壤中土壤酶活性的影响如图2。中性土壤添加OTC、ENR和SM2与对照组相比，均显著抑制中性土壤中脲酶活性，最高抑制率分别为 70.88%、73.70%和 76.96%（图 2a）。然而对过氧化氢酶活性均起到显著促进效果，最高促进率分别为73.13%、51.05%和124.09%，但添加ENR对于过氧化氢酶活性的促进作用呈先增强后逐渐减弱趋势，第 28天时过氧化氢酶活性低于对照组（图2b）。中性土壤中添加OTC和ENR对土壤中磷酸酶活性均产生先抑制后促进的效果，其中添加OTC后，磷酸酶活性在0—14 d内显著降低，且在第14天抑制效果最明显，抑制率为48.74%，之后活性逐渐上升并显著高于对照组，并在28 d促进程度最高，促进率为101.26%；添加ENR后，对磷酸酶在0—7 d内显著降低，7—21 d内显著增高，21 d后逐渐趋于一致，最高抑制和促进率分别为5.78%和17.26%；添加SM2后磷酸酶活性较对照组具有先促进后抑制的效果，在0—14 d内显著提升，14 d后促进程度逐渐减弱，抑制效果加强，21—28 d磷酸酶活性显著低于对照组，该组最大促进率和抑制率分别为33.24%和65.15%（图2c）。

图2 抗生素对中性土壤中酶活性的影响Figure 2 Effect of antibiotics on enzyme activity in neutral soil

2.3 抗生素对碱性土壤中土壤酶活性的影响

施加抗生素对碱性土壤中土壤酶活性的影响如图3。添加OTC与对照组相比对脲酶活性具有先抑制后促进效果，添加OTC后的0—14 d内脲酶活性受到显著抑制，抑制率达56.48%，14 d后抑制效果逐渐减弱，21—28 d脲酶活性显著上升并在28 d达到最高，最高促进率为28.43%；添加ENR和SM2对碱性土壤中脲酶活性均具有显著抑制作用，且抑制效果随时间推移逐渐增强，在第28 d抑制程度最高，抑制率分别为55.88%和96.08%（图3a）。添加OTC、ENR和SM2对过氧化氢酶活性均具有促进作用，其中添加OTC和SM2后对土壤中过氧化氢酶活性促进作用较对照组相比持续显著提高，第28天促进程度最高，最高促进率分别为 92.04%和102.17%，而添加ENR后促进效果随培养时间先上升后下降，最高促进率为46.73%，在第28天过氧化氢酶活性显著低于对照组（图3b）。添加OTC对磷酸酶活性具有先抑制后促进的作用，添加 OTC后0—14 d内磷酸酶活性显著降低，14 d后抑制效果逐渐减弱，磷酸酶活性逐渐增强，21—28 d磷酸酶活性显著高于对照组，但21 d后促进效果减弱，该组最高促进率和抑制率分别为 205.93%和86.62%；添加ENR和SM2对磷酸酶活性均具有先促进后抑制的作用，其中添加ENR后磷酸酶活性在0—21 d内显著提升，最高促进率为65.19%，但21 d后促进效果减弱；添加SM2对磷酸酶活性在0—7 d内具有显著促进作用，7 d后促进效果减弱，抑制程度加深，21 d后磷酸酶活性显著低于对照组，最高促进率和抑制率分别为 35.22%和73.33%（图3c）。

图3 抗生素对碱性土壤中酶活性的影响Figure 3 Effect of antibiotics on enzyme activity in alkaline soil

3 讨论

土壤酶作为土壤生物化学特征的主要成分，以“催化剂”的作用参与到土壤中各种物质交换和能量流动过程（Jabborova et al.，2021）。有研究表明，土壤中的脲酶能够影响土壤的供氮水平；过氧化氢酶能够影响腐殖质的分解与合成及化合物氧化速率，并对土壤中有害物质也具有分解作用；磷酸酶能够通过酶促反应分解土壤中难溶性有机磷从而提升土壤中有效磷含量（Ma et al.，2020；Chen et al.，2021；Siwach et al.，2021）。因此，土壤酶活性在土壤肥力的改变中起到重要作用。本研究中，抗生素对土壤中土壤酶活性的影响与抗生素的类型、土壤的类型及暴露时间都有着密切关系。已有资料表明，抗生素的类型、土壤的类型及暴露时间均会对土壤酶活性产生影响（Zhang et al.，2013）。

3.1 抗生素对不同土壤中脲酶活性的影响

本研究发现，3种抗生素对不同土壤中脲酶活性均有明显的抑制作用，这可能是抗生素的毒害作用导致土壤微生物的死亡，从而导致脲酶活性受到抑制。其中，OTC能够通过特异性地与糖体30S亚基中A点位结合，阻止氨基酰-tRNA在该位点上的联结，影响蛋白质的合成，从而致死微生物；ENR能够作用于细菌遗传物质核酸、DNA螺旋酶的 A亚单位，通过影响酶的正常功能抑制DNA合成与复制，使细胞不再分裂导致微生物的死亡；磺胺类药物与氨基苯甲酸（PABA）具有类似结构，二者产生竞争关系影响微生物细胞内二氢叶酸合成酶，进而抑制四氢叶酸的含量并抑制微生物的增殖（徐东峰，2000；程章，2009）。因此认为这 3种抗生素会通过影响土壤中相关微生物活性，最终导致脲酶活性的降低。通过比较OTC在不同土壤pH下对脲酶的影响趋势发现，在培养周期内，OTC在酸性与中性土壤中可以持续抑制脲酶活性，而在碱性土壤中呈现出先抑制后解除的变化趋势。而这一现象的可能原因是 OTC在酸性与中性土壤中的稳定性更高，而在碱性土壤中容易降解（范菲菲等，2013）。张书菡（2019）在抗生素抑制土壤脲酶的毒性效应与机制的研究中发现，四环素类、β-内酰胺类等抗生素对土壤中脲酶活性均有很强的抑制作用，与本研究结果一致。Lahr et al.（2005）研究表明，土霉素等抗生素对土壤微生物呼吸具有抑制作用，而呼吸作用反映微生物总活性，微生物活性的降低会导致酶活的减弱，也从侧面验证了本研究结果。

3.2 抗生素对不同土壤中过氧化氢酶活性的影响

本研究发现，3种抗生素对不同土壤中过氧化氢酶活性均有明显的促进作用。当土壤微生物受到抗生素毒害时会产生胁迫作用，需要分泌更多过氧化氢酶来抵抗土霉素毒害（刘莉莉等，2008）。张文婕等（2020）研究结果表明，施加中低浓度的恩诺沙星土壤中的过氧化氢酶具有相对明显的激活作用，这与本研究结果相一致。吴杰等（2019）的研究结果表明，磺胺二甲嘧啶对微生物群落有激活作用，可能正是这种激活作用促进微生物对过氧化氢酶的分泌，使得过氧化氢酶活性呈不断提高的结果。此外，还有研究结果显示，土壤中的有机质对于土壤酶本身具有一定的保护作用（汪杏等，2016），并且土壤对于抗生素具有一定的吸附缓冲效果，从而造成了抗生素对于土壤酶的毒害作用得到缓解的现象，并结合微生物受到抗生素毒害所产生的胁迫作用，最终表现出对于过氧化氢酶活性的促进作用。

3.3 抗生素对不同土壤中磷酸酶活性的影响

本研究发现，3种抗生素对不同土壤中磷酸酶活性的影响情况较为复杂，其中 OTC对于不同土壤中磷酸酶活性均呈现先抑制后促进的作用，ENR对酸性、碱性土壤中磷酸酶活性呈现先促进后抑制的作用而对中性土壤中磷酸酶活性呈现先抑制后促进的作用，SM2对不同土壤中磷酸酶活性均呈现先促进后抑制的作用。其造成不同抗生素、不同土壤环境中磷酸酶活性变化差异的主要原因，可能是抗生素毒害作用和微生物由此产生的胁迫作用共同影响导致的。陈智学（2013）进行了土霉素对酶活性及微生物群落代谢影响的研究，其结果表明，受土霉素影响后磷酸酶活性处于先降后升再降的变化趋势，与本研究结果一致。毛书帅（2016）研究结果也表明，单独施加恩诺沙星7 d后对土壤磷酸酶活性具有激活作用。Liu et al.（2009）研究结果表明，磺胺二甲嘧啶对磷酸酶有显著影响，且杨玖（2014）研究结果也表明，磺胺二甲嘧啶对磷酸酶活性会产生显著的抑制作用，试验结果均与本试验结果一致。

由于土壤性质的不同，抗生素在不同土壤中的吸附、解吸、迁移转化也会存在差异。鲍艳宇（2008）研究发现，四环素类抗生素在不同土壤中都是物理吸附，但在不同土壤中的解吸具有一定程度的滞后性和差异性。本研究中，酸性和中性土壤中添加OTC后，脲酶活性持续受到抑制，而碱性土壤中添加 OTC则出现先抑制后促进的现象，可能是由于不同酸碱度土壤对于OTC的吸附所存在的差异性，同样的差异性也体现在酸性土壤中添加 OTC后过氧化氢酶活性变化与中、碱性土壤中添加 OTC的不同。李鑫（2015）在四环素类抗生素在不同质地土壤中的迁移模拟研究中发现，不同质地土壤对四环素和土霉素的吸附存在快速吸附过程和慢速平衡过程的不同，四环素和土霉素在砂土中具有明显的迁移效果。本研究中，3种不同抗生素添加到 3种土壤中，磷酸酶活性变化情况出现较为明显差异，可能是由于土壤的机械组成对抗生素的吸附和迁移产生了影响所导致的。

单一的污染物其自身的理化性质决定了其对于土壤微生物的毒性效应，而复合污染条件下，污染物的理化性质及污染物的浓度等众多因素均对其最终毒性效应产生同等重要的作用。张晨等（2018）通过典型磺胺类抗生素对土壤脱氢酶和过氧化氢酶活性的影响研究表明，复合污染物对土壤酶活性的效应与染毒质量比及土壤酶的种类等均相关。李凯旋（2018）在研究中发现，三氯生和克拉霉素复合污染情况下对土壤脲酶活性表现为高浓度抑制效应，而对过氧化氢酶活性表现为低浓度抑制。复合污染物的作用机理可为竞争结合位点、影响生物酶活性等多种途径产生作用（Ensenbach et al.，1997；Donnelly et al.，1998），并产生不同效果，但当前对于复合抗生素污染物对土壤酶活性影响的研究还较少。本研究补充了抗生素残留背景下不同类型土壤的土壤酶活变化情况，但由于影响土壤酶敏感性的生物和理化因素的复杂性，研究仅分析了抗生素对酶活的相对作用，还需要进一步的研究来确定微生物数量、活动和群落组成变化的情况，更准确的揭示抗生素影响下土壤生态系统功能稳定性及其驱动机制。

4 结论

本实验通过采集不同土壤样本，对土壤添加抗生素进行试验，研究土霉素、恩诺沙星和磺胺二甲嘧啶3种抗生素对酸性、中性和碱性土壤中土壤酶活性的影响。实验结果表明，3种抗生素处理后，农田土壤中脲酶活性整体呈现抑制趋势，过氧化氢酶活性整体呈现促进趋势，磷酸酶活性在不同抗生素之间存在显著的差异性。抗生素的残留会削弱土壤氮循环相关酶的代谢功能及稳定性，从而减弱土壤物质循环及土壤生态系统的功能稳定性。