三叶苷对下肢缺血再灌注小鼠肾损伤的保护作用

王 磊，白艳辉，王 鹏，李爱军，张冬芹，史 坚，王秀丽

（1.河北医科大学第三医院麻醉科，石家庄 050051；2.保定市第一中心医院麻醉科，保定 071000；3.保定市第一中心医院老年科，保定 071000；4.保定市第一中心医院心外科，保定 071000）

下肢缺血再灌注（lower-limb ischemia reperfusion，LIR）是肾损伤的主要原因之一，其机制可能是缺血缺氧致线粒体功能受损，使细胞肿胀坏死，再灌注过程中炎性级联反应使损伤进一步加重[1-2]。研究[3]发现，近端肾小管线粒体的改变是肾脏疾病发生、发展的重要标志。沉默信息调节因子3（SIRT3）位于线粒体内，参与线粒体的多种生物调节功能，如抗氧化应激、能量合成代谢、细胞裂变融合等多个过程[4-5]。通过上调SIRT3可抑制氧化应激，以减轻器官缺血再灌注损伤[6]。超氧化物歧化酶2（superoxide dismutase 2，SOD2）是一种特定位于线粒体内的SOD，属于抑制线粒体活性氧的清除酶。研究[7]发现，SIRT3通过上调线粒体内的SOD2表达，可提高线粒体清除活性氧的能力。三叶苷（trilobatin，TLB）是从多穗柯叶中提取的一种天然甜味剂，具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、抗病毒等作用[8-9]。TLB通过抗炎、抗氧化作用可缓解脑缺血再灌注所致的神经损伤[10]，目前TLB是否对LIR所致肾损伤有保护作用尚不清楚。本研究旨在探讨预处理TLB对小鼠LIR所致肾损伤的保护作用及其机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及材料、设备

1.1.1 实验动物8~10周龄雄性C57BL6小鼠60只，均由中国医学科学院放射医学研究所提供（动物许可证编号：2021002），并由医院伦理委员会批准（2021036）。

1.1.2 主要材料及设备TLB购自成都普瑞法科技开发有限公司（批号：PRF15092821）；沉默信息调节因子3（silent information regulator 3，SIRT3）选择性抑制剂购自美国Selleck生物科技有限公司（批号：S862801，纯度99.90%）；丙二醛（malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、二氢乙啶（dihydroethidium，DHE）试剂盒均购自上海碧云天生物技术有限公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司；抗体SIRT3、抗体SOD2购自美国Abcam公司；抗体GAPDH购自美国Proteintech Group公司；彩色多普勒超声（型号Vevo2100）购自加拿大VisualSonics公司；石蜡切片机（型号RM2235）购自德国Leica公司；酶标仪（型号ELX-800）购自美国BioTek公司；凝胶成像系统（型号WD-9413B）、双垂直蛋白电泳仪（型号DYCZ-24DN）购自北京六一生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 模型制备 参照文献[11]行LIR模型制备，采用巴比妥钠对小鼠进行麻醉后，用止血带结扎双后肢根部造成后肢缺血，缺血3 h后松解止血带，并对双后肢进行按摩以加速血流复灌，再灌注3 h后处死小鼠进行实验研究，见图1A。整个制备过程使用彩色多普勒超声探测血流以保证模型制备成功。

1.2.2 动物分组 将60只小鼠采用随机数表法分为4组（n=15），即对照组：小鼠建立假手术前3 d，给予等量生理盐水，在模型制备过程中仅行麻醉，不进行双后肢根部止血带的结扎；损伤组：造模前3 d，给予小鼠等量生理盐水，行LIR模型制备；预处理组：造模前3 d，通过灌胃方式给予小鼠TLB 15 mg·kg-1，2次/d，连续3 d，之后行LIR模型制备；抑制剂组：造模前3 d，一次性经腹腔注射SIRT3选择性抑制剂（3-TYP）50 mg·kg-1，后续操作同预处理组，见图1B。

图1 动物实验流程图

1.3 检测指标

1.3.1 检测血清血肌酐（serum creatinine，Scr）、尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）浓度 抽取小鼠外周血，离心、留取上清，采用Beckman AU5800全自动生化分析仪检测。

1.3.2 苏木精-伊红（hematoxylin-eosin staining，HE）染色观察小鼠肾组织病理形态及病理损伤评分 取小鼠肾组织，经固定、修剪、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、脱蜡、至水、染色、封片处理后，显微镜下观察肾组织形态。参照文献[12]进行肾脏病理损伤评分，1分：肾间质炎性细胞浸润；1分：肾间质充血；1分：细胞核固缩；1分：肾小管腔内脱落、坏死的细胞；1分：上皮细胞颗粒变性；1分：肾小管显著扩张、细胞扁平；0分：正常肾小管。

1.3.3 DHE染色检测小鼠肾组织中活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平 处死小鼠取新鲜肾组织，将部分肾组织置于样本托上，使用OCT包埋剂包埋样本，用切片机将肾组织切成10 μm的薄片，将组织薄片吸附于载玻片上。晾干后于-70℃冰箱中保存。滴加DHE试剂，37℃避光孵育30 min。胶头滴管滴加抗荧光淬灭剂，盖玻片封片。

1.3.4 小鼠肾组织MDA、SOD测定 处死小鼠取部分肾组织进行研磨，加入裂解液（肾组织重量占裂解液的比例为10%）进行裂解，于4℃、14 000 r·min-1离心10 min，留取上清待测。样品准备完毕后用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度。用MDA检测试剂盒测定小鼠血浆MDA水平，严格按照说明书进行操作，酶标仪检测532 nm各孔吸光值；用SOD检测试剂盒测定小鼠血浆SOD水平，严格按照说明书进行操作，酶标仪检测550 nm各孔吸光值。

1.3.5 Western blot法检测小鼠肾组织SIRT3表达 取部分肾组织进行研磨，加入细胞裂解液和蛋白酶抑制剂PMSF冰上裂解2 h后，低温离心后取上清，95℃变性10 min，PAGE电泳分离后转至PVDF膜，分别加入一抗（抗SIRT3、抗体SOD2、内参抗体GAPDH）置摇床孵育2 h，弃一抗，TBST漂洗后加入辣根过氧化酶标记的山羊抗鼠二抗（北京索莱宝科技有限公司），孵育1 h，弃二抗，TBST漂洗，用化学发光法曝光显影，采用Quantity one软件进行分析，以各目的蛋白条带灰度值与GAPDH条带灰度值的比值反映各目的蛋白表达。

1.4 统计学方法

采用SPSS 26.0统计学软件进行数据分析，正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用方差分析，组间两两比较采用LSD-t法。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TLB对LIR肾损伤小鼠肾功能的影响

与对照组相比，损伤组小鼠血清中Scr、BUN水平升高（P均＜0.05）；与损伤组比较，预处理组血清Scr、BUN水平降低（P均＜0.05）；与预处理组比较，抑制剂组血清Scr、BUN水平升高（P均＜0.05），见表1。

表1 各组间小鼠肾功能指标比较（±s）

表1 各组间小鼠肾功能指标比较（±s）

与对照组比较*P<0.05；与损伤组比较#P<0.05；与预处理组比较&P<0.05。

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2.2 TLB对LIR肾损伤小鼠肾组织形态及损伤评分的影响

光镜下观察，对照组小鼠肾小管上皮细胞结构完整，肾小球及间质无明显病理学改变，未见炎性细胞浸润；与对照组比较，损伤组小鼠可见肾小球毛细血管扩张充血，并伴有大量炎性细胞浸润，肾小管上皮细胞肿胀坏死，肾损伤评分增高（P＜0.05）；与损伤组比较，预处理组小鼠肾小球毛细血管扩张充血较轻，偶见炎性细胞浸润、肾小管上皮细胞坏死脱落表现，损伤评分降低（P＜0.05）；与预处理组比较，抑制剂组小鼠光镜下表现同损伤组，且损伤评分增高（P＜0.05），见图2、表2。

图2 各组小鼠肾组织结构变化（HE×400，bar=100 μm）

表2 各组间小鼠肾组织病理评分比较（±s，分）

表2 各组间小鼠肾组织病理评分比较（±s，分）

与对照组比较*P<0.05；与损伤组比较#P<0.05；与预处理组比较&P<0.05。

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2.3 TLB对LIR肾损伤小鼠氧化应激指标的影响

与对照组相比，损伤组小鼠肾组织中ROS、MDA含量升高，SOD活性下降（P＜0.05）；与损伤组比较，预处理组小鼠肾组织中ROS、MDA含量降低，SOD活性提高（P＜0.05）；与预处理组比较，抑制剂组小鼠肾组织中ROS、MDA含量升高，SOD活性下降（P＜0.05），见图3、表3。

表3 各组小鼠氧化应激指标比较（±s）

表3 各组小鼠氧化应激指标比较（±s）

与对照组比较*P<0.05；与损伤组比较#P<0.05；与预处理组比较&P<0.05。

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图3 各组小鼠下肢缺血再灌注后肾组织中ROS水平（DHE×200，bar=100 μm）

2.4 TLB对LIR肾损伤小鼠SIRT3/SOD2通路的影响

与对照组相比，损伤组小鼠SIRT3、SOD2蛋白相对表达下调（P<0.05）；与损伤组相比，预处理组小鼠SIRT3、SOD2蛋白相对表达上调（P<0.05）；与预处理组比较，抑制剂组小鼠SIRT3、SOD2蛋白相对表达下调（P<0.05），见图4、表4。

表4 各组间小鼠SIRT3/SOD2通路蛋白相对表达比较（±s）

表4 各组间小鼠SIRT3/SOD2通路蛋白相对表达比较（±s）

与对照组比较*P<0.05；与损伤组比较#P<0.05；与预处理组比较&P<0.05。

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图4 Western blot检测肾组织SIRT3/SOD2通路的蛋白相对表达情况

3 讨论

肢体长时间缺血后突然再灌注，远隔组织如心脏、肺脏、肾脏等器官会出现不同程度的受损，严重者甚至出现多脏器功能衰竭和休克[13-14]。在探讨LIR肾损伤的发生发展过程中，动物模型作为损伤研究的基础，可模拟其发病原因、病理过程和临床特征，为进一步研究其发病机制及治疗预后提供基础。在模型制备完成后，光镜下可见对照组小鼠肾小管结构完整，无炎性细胞浸润，而损伤组小鼠肾组织形态结构发生改变，提示LIR肾损伤模型制备成功。

TLB是从多穗柯叶中提取的二氢查耳酮类化合物，具有抗炎、抗氧化等作用。研究[15]发现，TLB可通过提高SOD活性，降低脂质过氧化产物MDA及乳酸脱氢酶含量，减轻氧化应激损伤，从而对缺氧缺糖诱导的心肌细胞起到保护作用。本研究进一步证实，LIR所致的肾损伤中肾组织氧化应激因子中氧化剂（ROS）及产物（MDA）的生成与抗氧化剂（SOD）防御之间的失衡，预处理组TLB可改善上述指标变化，提示预处理TLB可通过抑制氧化应激反应改善小鼠LIR肾损伤，而抑制剂组通过抑制SIRT3的表达，可减弱TLB在氧化应激方面的保护作用，从而加重小鼠LIR所致的肾损伤。

哺乳动物Sirtuins家族共有7个成员（包括SIRT1-7），其中SIRT3主要定位在线粒体基质中，作为主要的应激反应蛋白去乙酰化酶，参与机体炎性、氧化应激的调节，在缺血再灌注损伤中起着至关重要的作用[16-17]。Wang等[18]发现，过表达SIRT3可抑制炎症，对抗氧化应激损伤，减少肾小管上皮细胞凋亡，改善体内外肾缺血再灌注损伤具有重要作用。敲除SIRT3会加重小鼠肾损伤、氧化应激以及凋亡[19]。这与本实验结果基本一致。

SIRT3调控线粒体功能主要表现为增加SOD2活性、降低细胞ROS水平和提高机体抗氧化应激能力[20]。本研究发现，预处理组小鼠TLB通过上调SIRT3蛋白表达，致SOD2表达增强。值得注意的是，抑制剂组小鼠由于阻断了SIRT3表达，从而削弱了TLB改善LIR肾损伤的作用，推测其机制可能是TLB通过上调线粒体内的SIRT3表达，使SOD2活力增强，进而抑制超氧化物生成，减轻氧化应激反应，从而改善LIR所致的肾损伤。肾损伤作用机制十分复杂，并非由单一细胞因子起决定性作用，还有其他细胞因子和炎性介质的相互作用、相互制约，共同调节肾损伤的发生发展，这也是本课题组进一步的研究方向。

综上所述，TLB可减轻氧化应激反应，改善小鼠LIR所致的肾损伤，其部分机制可能与SIRT3/SOD2信号通路激活有关。