湖北海棠化学成分研究

张 曼,鞠炎锟，梅之南，熊 慧

(中南民族大学 药学院,湖北 武汉 430074)

1 引言

湖北海棠(Malushupehensis(Pamp.) Rehder)是蔷薇科苹果属植物[1]。该植物在我国分布广泛且应用历史悠久[2]。根据《中华草本》记载, 其嫩叶作茶叶应用已有400多年的历史[3]。分布于华东、西南及山西、陕西、甘肃、河南、湖北、湖南、广东等地[4]。已有众多对湖北海棠的药理作用进行了广泛的研究，现已经通过实验数据证实的药理作用包括：降血糖、雌激素样作用、保肝护肝、抗病原微生物[5，6]。研究表明，根皮苷及黄酮类成分是发挥药理作用的主要药效成分[7，8]。为进一步研究其药效物质基础,通过溶剂提取法、聚酰胺柱层析以及高效液相色谱等分离技术[9，10], 并通过现代波谱技术分析比对鉴定化合物的结构, 从70%乙醇提取物中分离与鉴定出11个化合物(图1)，其中包含9个结构类型多样的黄酮类化合物，本文将介绍这些化合物的分离与结构鉴定的详细过程。

图1 化合物1～11的化学结构式

2 仪器、试剂及药材

由德国布鲁克公司生产的核磁共振波谱仪(AVANCEIIITM, 500MHz), thermo半制备型色谱柱(250 nm×10 nm, 5 μm), 由上海贝茵科技有限公司生产的SHB-111A型循环水式多用真空泵, 由常州奥豪斯仪器有限公司生产的AX224ZH/E型电子天平, 由上海顾村电光科技有限公司生产的ZF-1型三用紫外分析仪, 由上海亚荣生化科技有限公司生产的RE2000A型旋转蒸发仪, 由杭州瑞析科技有限公司生产的Waters半制备型高效液相色谱仪, 由青岛海洋化工生产的柱色谱硅胶(200～300目)和聚酰胺粉(100-200目), 由上海国药集团有限公司生产的甲酸、甲醇、乙醇(分析纯) ,来自Sigma商城的甲醇(色谱纯)和乙腈(色谱纯, Sigma商城),由青岛海洋化工生产的GF254型硅胶板。

湖北海棠采自湖北省宜昌市,由中南民族大学药学院的熊慧博士鉴定为蔷薇科苹果属(Malushupehensis(Pamp.) Rehder)的叶, 实验剩余植物存放于中南民族大学药学院。

3 提取与分离

干燥的湖北海棠叶称取3 kg粉碎后用70%的乙醇室温浸提3次, 分别浸提24 h, 12 h, 12 h, 将3次提取液抽滤，弃去滤渣,合并提取液, 用旋转蒸发仪至用密度计测量后相对密度约为1.2, 约1500 mL, 加入3倍量约4500 mL的95%乙醇进行醇沉,室温16 ℃静置过夜抽滤得到上清液, 减压浓缩至浓缩液没有乙醇味即乙醇含量极少以便于进行下一步萃取,约1200 mL, 用等体积的乙酸乙酯萃取3次, 将乙酸乙酯层合并减压浓缩得到浸膏300 g, 加入1500 mL超纯水, 回流至固体全部溶解, 趁热抽滤,弃去滤渣, 边搅拌滤液边等待滤液自然冷却,静置一晚后,所有液体混匀后用10 mL的EP管分装,再分次用3000转离心机离心10 min后弃去上清液, 得到的沉淀用甲醇溶解, 弃去的上清液合并后再静置一晚重复离心步骤,合并溶解液得到1000 mL液体,减压浓缩后得到110 g固体, 上聚酰胺柱(100～200目, 0.75 kg), 用30%乙醇洗脱, 通过薄层检测, 合并相同部分得到5个组分(Fr.A～E).Fr.B上硅胶柱, 依次用二氯甲烷-甲醇为流动相梯度洗脱(95∶5,90∶10,80∶20,0∶1), 通过薄层检测, 合并相同部分得到4个组分(Fr.B1-B4), Fr.B1经过半制备高效液相色谱(流动相∶乙腈∶0.1%甲酸水=4∶6)得到化合物11(5.3mg, tR= 20 min)、12(6mg, tR = 25 min); Fr.B2经过半制备高效液相色谱(流动相∶乙腈∶0.1%甲酸水=3∶7)得到化合物1(2.19g, tR = 31 min); Fr.B3经过半制备高效液相色谱(流动相∶乙腈∶0.1%甲酸水=3∶7)得到化合物2(300 mg, tR= 23 min), 3(7 mg, tR = 18 min), 4(2.8 mg, tR= 12 min),5(2.9 mg, tR= 22 min),6(6.6 mg, tR= 14 min), 7(7 mg, tR= 37.5 min); Fr.E经过半制备高效液相色谱(流动相∶乙腈∶0.1%甲酸水=35∶65)得到化合物8(5 mg, tR= 21 min),9(17 mg, tR= 10 min)。

4 结构鉴定

化合物1为白色粉末, 硫酸-香草醛显黄色, 由NMR数据推出化合物的分子式为C21H24O10, 1H-NMR(CD3OD,500 MHz)δH:7.06(1H, d, J = 8.5 Hz, H-2, 6), 6.69(2H, d, J = 8.5 Hz, H-3, 5), 6.18(1H, d, J = 2.5 Hz, H-3′), 5.96(1H, d, J = 2.0 Hz, H-5′), 5.04(1H, d, J = 7.0 Hz, H-1′′), 3.91(1H, dd, J = 12.0, 2.0 Hz, H-6′′a), 3.72(1H,dd,J = 12.0,4.5 Hz,H-6′′b), 2.88(2H, t, J = 8.0 Hz, H-7)。13C-NMR(CD3OD, 125 MHz)见表1。

该波谱数据和文献[11]比对后,基本一致, 最终鉴定该化合物为根皮苷。

化合物2为白色粉末,硫酸-香草醛显黄色, 由NMR数据推出化合物的分子式为C21H24O11, 1H-NMR(CD3OD,500 MHz)δH:6.70(1H, d,J = 2.0 Hz, H-2), 6.66(1H,d,J = 8.0 Hz,H-5), 6.56(1H,dd,J = 7.0, 2.0Hz, H-6), 6.18(1H,d,J = 2.0 Hz,H-3′), 5.96(1H,d,J = 2.0 Hz,H-5′), 5.04(1H, d, J = 7.5 Hz, H-1′′), 4.00(1H, dd, J = 12.0 Hz, 2.0Hz, H-6′′a), 3.73(1H, dd, J = 12.0Hz, 5.0 Hz, H-6′′b), 2.88(2H,m,H-7).13C-NMR(CD3OD, 125 MHz)见表1。

该波谱数据和文献[18]比对后,基本一致,最终鉴定该化合物为3-羟基根皮苷。

化合物3为黄色粉末, 硫酸-香草醛显黄色, 根据圆二色谱结果, 二氢黄酮在300～340 nm处显示负Cotton效应, 可推定C-2的绝对构型为S, 由NMR数据推出化合物的分子式为C21H22O10, 1H-NMR(CD3OD, 500 MHz)δH: 5.36(1H, dd, J = 12.5, 3.0 Hz, H-2), 3.10(1H, dd, J = 16.5, 12.5 Hz, H-3a), 2.66(1H, dd, J = 16.5, 3.0 Hz, H-3b), 6.42(1H, d, J = 2.3 Hz, H-6), 6.12(1H, d, J = 2.3 Hz, H-8), 7.31(2H, d, J = 8.5 Hz, H-2′, 6′), 6.81(2H, d, J = 8.5 Hz, H-3′, 5′), 4.83(1H, d, J = 7.5 Hz, H-1′′), 3.92(1H, dd, J = 12.0, 2.0 Hz, H-6′′a), 3.74(1H, dd, J = 12.0, 4.5 Hz, H-6′′b)。13C-NMR(CD3OD, 125 MHz)见表1。以上波谱数据与文献[14]对照基本一致, 故鉴定化合物为2S-茎草素-5-O-β-D-葡萄糖苷。

化合物4为黄色粉末, 硫酸-香草醛显黄色, 根据圆二色谱结果, 二氢黄酮在300～340 nm处显示负Cotton效应时，可推定C-2的绝对构型为S, 由NMR数据推出化合物的分子式为C21H22O11, 1H-NMR(CD3OD, 500 MHz)δH: 5.29(1H, dd, J = 12.0, 2.5 Hz, H-2), 3.05(1H, dd, J = 15.5, 12.0 Hz,H-3a), 2.66(1H, dd, J = 16.0, 2.5 Hz, H-3b), 6.42(1H, d, J= 2.3 Hz, H-6), 6.12(1H, d, J = 2.3 Hz, H-8), 6.91(1H, s, H-2′), 6.78(2H, m, H-5′, 6′), 4.83(1H, d, J = 8.0 Hz, H-1′′), 3.92(1H, dd, J = 11.0, 1.5 Hz, H-6′′a), 3.74(1H, dd, J = 13.5, 3.5 Hz, H-6′′b)。13C-NMR(CD3OD, 125 MHz)见表1。以上波谱数据与文献[12]对照基本一致,故鉴定化合物为2S-柚皮素-5-O-β-D-葡萄糖苷。

化合物5为黄色粉末,硫酸-香草醛显黄色,根据圆二色谱结果, 二氢黄酮在300～340 nm处显示正Cotton效应时, 可推定C-2的绝对构型为R, 由NMR数据推出化合物的分子式为C21H22O10, 1H-NMR(CD3OD, 500 MHz)δH: 5.33(1H, dd,J = 13.5, 3.0 Hz,H-2), 3.01(1H, dd, J = 17.5, 13.0 Hz,H-3a), 2.72(1H, dd, J = 17.0, 3.0 Hz, H-3b), 6.48(1H, d, J= 2.5 Hz, H-6), 6.14(1H, d, J = 2.5 Hz, H-8), 7.31(2H, d, J = 8.5 Hz, H-2′, 6′), 6.81(2H, d, J = 8.5Hz, H-3′, 5′), 4.78(1H, d, J = 7.5 Hz, H-1′′), 3.94(1H, dd, J = 12.0, 2.0 Hz, H-6′′a), 3.76(1H, dd, J = 12.0, 5.0 Hz, H-6′′b)。13C-NMR(CD3OD, 125 MHz)见表1。以上波谱数据与文献[12]对照基本一致,故鉴定化合物为2R-茎草素-5-O-β-D-葡葡萄糖苷。

化合物6为黄色粉末,硫酸-香草醛显黄色,根据圆二色谱结果, 二氢黄酮在300～340 nm显示正Cotton效应时, 可推定C-2的绝对构型为R, 由NMR数据推出化合物的分子式为C21H22O11, 1H-NMR(CD3OD, 500 MHz)δH: 5.28(1H, dd,J = 13.0, 3.0 Hz,H-2), 2.96(1H, dd, J = 17.0, 12.5 Hz, H-3a), 2.71(1H, dd, J = 17.5, 3.0 Hz, H-3b), 6.48(1H, d, J= 2.5 Hz, H-6), 6.14(1H, d, J = 2.5 Hz, H-8), 6.91(1H,d, J = 1.0 Hz, H-2′), 6.78(2H, m, H-5′, 6′), 4.77(1H, d, J = 8.0 Hz, H-1′′), 3.95(1H, dd, J = 12.5, 2.0 Hz, H-6′′a), 3.75(1H, dd, J = 12.0, 5.5 Hz, H-6′′b)。13C-NMR(CD3OD, 125 MHz)见表1。以上波谱数据与文献[14]对照基本一致,故鉴定化合物为2R-柚皮素-5-O-β-D-葡萄糖苷。

化合物7为黄色粉末,硫酸-香草醛显黄色,由NMR数据推出化合物的分子式为C21H20O10, 1H-NMR(CD3OD,500 MHz)δH: 6.21(1H, d, J = 2.0 Hz, H-6), 6.38(1H, d, J = 2.0 Hz, H-8), 7.34(1H, d, J = 2.0 Hz, H-2′), 6.91(1H,d, J = 8.5 Hz, H-5′), 7.32(1H, dd, J = 8.5, 2.0 Hz, H-6′), 5.35(1H, s, H-1′′), 0.94(3H, d, J = 6.0 Hz, H-6′′)。13C-NMR(CD3OD, 125 MHz)见表1。

该波谱数据与文献[15～18]比对后,大体一致,最终鉴定此化合物为槲皮素-3-O-β-D-鼠李糖苷。

化合物8为黄色粉末,硫酸-香草醛显黄色,由NMR数据推出化合物的分子式为C21H20O12, 1H-NMR(CD3OD,600 MHz)δH: 6.20(1H, d, J = 2.4 Hz, H-6), 6.40(1H, d, J = 2.4 Hz, H-8), 7.61(1H, d, J = 2.4 Hz, H-2′), 6.86(1H,d, J = 8.4 Hz, H-5′), 7.59(2H, dd, J = 8.4, 2.4 Hz H-6′), 5.19(1H, d, J = 7.2 Hz H-1′′)。13C-NMR(CD3OD, 150 MHz)见表1。以上波谱数据与文献[19～21]比对后,基本一致,最终鉴定此化合物为槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷化合物 9为黄色粉末,硫酸-香草醛显黄色,由NMR数据推出化合物的分子式为C21H20O11, 1H-NMR(CD3OD,500 MHz)δH: 6.33(1H, s, H-5), 6.37(1H, s, H-7), 6.66(1H, s, H-10),7.49(2H, d, J = 2.0 Hz, H-2′), 6.84(1H,d, J = 8.5 Hz, H-5′), 7.21(2H, dd, J = 8.5, 2.0 Hz, H-6′),5.02(1H, d, J = 7.5 Hz, H-1′′)。13C-NMR(CD3OD, 125 MHz)见表1, 本文为首次报道该化合物碳谱数据,并通过2D-NMR归属所有NMR的信号见图2，故鉴定化合物为毛莨酢浆草苷[22，24～26]。

表1 化合物1-913C NMR数据

化合物10为黄色粉末, 硫酸-香草醛显黄色, 由NMR数据推出化合物的分子式为C9H10O3,1H-NMR(CD3OD, 600 MHz)δH: 2.66(2H, t, J = 7.8 Hz, H-8), 2.80(2H, t, J = 7.8 Hz, H-7), 6.69(2H, d,J = 8.4 HzH-3, 5), 7.03(2H, d,J = 8.4 Hz, H-2, 6),该波谱数据与文献[11]比对后,大体一致, 最终鉴定此化合物为对羟基苯丙酸。

化合物11为黄色粉末, 硫酸-香草醛显黄色,由NMR数据推出化合物的分子式为C9H6O4, 1H-NMR(CD3OD, 500 MHz)δH:7.91(1H, d, J = 6.0 Hz, H-2), 6.20(1H, d, J = 6.0 Hz, H-3), 6.21(1H, d, J = 2.0 Hz, H-6), 6.33(1H, d, J = 2.0 Hz, H-8),13C-NMR(CD3OD, 126 MHz)图谱中显示9个碳原子信号, δC:158.3(C-2), 111.8(C-3), 183.6(C-4), 163.6(C-5), 100.4(C-6), 166.4(C-7), 95.3(C-8), 160.1(C-9), 107.0(C-10)。以上波谱数据与文献[13]对照基本一致, 故鉴定化合物为5,7-二羟基色原酮。

续表1

4 结语

通过对湖北海棠70%乙醇提取物的分离与纯化,得到了11个化合物, 其中有9个为黄酮类化合物, 其结构分别鉴定为根皮苷(1)、3-羟基根皮苷(2)、2S-茎草素-5-O-β-D-葡萄糖苷(3)、2S-柚皮素-5-O-β-D-葡萄糖苷(4)、2R-茎草素-5-O-β-D-葡萄糖苷(5)、2R-柚皮素-5-O-β-D-葡萄糖苷(6)、槲皮素-3-O-β-D-鼠李糖苷(7)、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷(8)、毛莨酢浆草苷(9)、对羟基苯丙酸(10)、5, 7-二羟基色原酮(11), 9个黄酮类化合物,包括2个二氢查尔酮类,4个二氢黄酮醇类,2个黄酮醇类，1个橙酮类,且湖北海棠中未分离得到过橙酮类化合物,首次从湖北海棠这个植物中分离得到的化合物为化合物(7),化合物(8)和化合物(9),化合物(3)和(5)、(4)和(6)互为差向异构体, 该研究丰富了该植物化学成分的结构类型。