三种兽用消毒剂对伪狂犬病病毒的灭活效果研究

董建斐，张 璐，王雅婷，徐 辉，赵灵燕，谢荣辉

(浙江省动物疫病预防控制中心，浙江 杭州 310018)

自2018年我国发生非洲猪瘟以来，生物安全措施迅速得到提升，消毒剂使用不断增加，但各种消毒剂对非洲猪瘟病毒消毒效果还有待于进一步评估研究。猪伪狂犬病病毒和非洲猪瘟病毒均为DNA病毒，两者分子结构和理化特性非常相似，其中猪伪狂犬病病毒能在多种细胞中增殖，是一个很好的模式病毒[1]，由于非洲猪瘟属于高致病性动物病原微生物，许多实验室因生物安全级别不够不能开展病毒培养和消毒效果的研究，同时消毒剂对伪狂犬病病毒消毒效果的评价，也可在实际生产过程中为非洲猪瘟消毒剂的选择和使用提供依据。

目前虽然猪伪狂犬病疫苗大规模使用于养殖场，并有效地遏制了伪狂犬病的暴发和区域化流行，但仍有疫苗免疫猪场发生猪伪狂犬病[2-6]，彻底根除和净化猪伪狂犬病还需采取消毒等生物安全措施。当前仍有许多养殖场使用消毒剂作为预防和控制伪狂犬病等病毒性疫病发生的主要手段之一。为了正确指导猪伪狂犬病病毒消毒工作，消毒剂的选择至关重要。本试验旨在对常用兽用消毒剂灭活伪狂犬病病毒的效果进行评价，为临床应用提供常用兽用消毒剂稀释浓度和消毒效果数据。以GFP标记的gE/TK双基因缺失的伪狂犬病病毒为模式病毒，评估了碘酸混合液、戊二醛癸甲溴铵溶液和二氯异氰尿酸钠3种兽用消毒剂对伪狂犬病病毒的杀灭效果。

1 材料与方法

1.1试验材料 试验用消毒剂碘酸混合液(20200404)、戊二醛癸甲溴铵溶液(20200204)和二氯异氰尿酸钠(20190410)均为国内市售产品。DMEM细胞培养液、胎牛血清、链霉素和青霉素双抗溶液均为Gibco产品。GFP标记的gE/TK双基因缺失的伪狂犬病病毒(以下简称重组伪狂犬病弱病毒)由浙江省农业科学院畜牧兽医研究所惠赠。

1.2试验方法

1.2.1重组伪狂犬病弱病毒扩增和病毒悬液制备 吸取0.1 mL病毒液至生长有单层BHK21细胞的75 cm2细胞培养瓶中，再向细胞培养瓶中加入30 mL含3%胎牛血清的DMEM细胞培养液，将细胞培养瓶置于37 ℃培养箱中培养，每日观察细胞病变和细胞中的绿色荧光，当细胞病变达到80%-90%时，将培养瓶置于-80 ℃冻融三次，1000 rpm离心10 min，吸取上清后加入胎牛血清使病毒液中的胎牛血清达到10%，病毒液分装于2 mL保存管，于-80 ℃冰箱中保存备用。

1.2.2重组伪狂犬病弱病毒滴度测定 将扩增后的重组伪狂犬病病毒用PBS进行10倍系列稀释，分别接种于生长有单层BHK21细胞(96孔板)中，每个稀释度接种8孔，置于37 ℃、5%二氧化碳培养箱中培养，每日在荧光显微镜下观察细胞中的荧光，连续观察5 d，按Reed-Muench法计算该病毒的半数细胞感染剂量(TCID50)。

1.2.3病毒灭活试验 试验组用PBS将消毒剂稀释成不同浓度，取重组伪狂犬病病毒液与等量不同浓度的消毒剂混合，分别在室温(24 ℃)、37 ℃和4 ℃环境下作用一定时间(2 min, 5 min, 10 min, 15 min, 20 min, 25 min, 30 min, 40 min)后，立即用含10%胎牛血清的DMEM培养基稀释100倍，将细胞培养板中的培养液吸出并用PBS洗二次，将上述稀释好的消毒剂与病毒混合液加入相应孔(24孔板)中，置于37 ℃、5%二氧化碳培养箱中吸附1-2 h，然后将液体吸出，PBS清洗二次后加入含3%胎牛血清的DMEM溶液，置于37 ℃、5%二氧化碳培养箱中培养，每日在荧光显微境下观察细胞中的荧光。阳性对照组为200倍稀释的重组伪狂犬病病毒液，消毒剂为最高浓度消毒液经100倍稀释后与等量100倍稀释后的混合液。阴性对照组为经200倍稀释后的最高浓度的消毒剂。

1.2.4灭活率计算 病毒灭活率=[(对照组病毒含量-消毒剂组病毒含量)/对照组病毒含量]×100%。若消毒剂灭活病毒不彻底，则按1.2.2方法测定灭活前后病毒的TCID50的变化计算灭活率。

2 结果

2.1戊二醛癸甲溴铵溶液对伪狂犬病病毒的灭活效果 结果显示，在常温(20 ℃)下0.2%戊二醛癸甲溴铵溶液与伪狂犬病病毒作用5 min，就可将其完全灭活；而在低温环境下，0.2%的戊二醛癸甲溴铵溶液作用40 min仍未能彻底灭活病毒，表明该消毒剂受温度的影响较大。

表1 戊二醛癸甲溴铵溶液对伪狂犬病病毒灭活效果

2.2碘酸混合溶液对伪狂犬病病毒的灭活效果 结果显示，在常温(20 ℃)下0.05%的碘酸混合溶液作用10 min方可完全灭活伪狂犬病病毒，但37 ℃环境下0.05%的碘酸混合溶液5 min即可完全灭活伪狂犬病病毒。由于0.1%和0.2%的碘酸混合液对细胞毒性较大，接种消毒剂和病毒混合液后细胞脱落和发生淍亡，无法判定病毒的感染状况。

2.3二氯异氰尿酸钠对伪狂犬病病毒的灭活效果 结果显示，在常温(20 ℃)下，有效氯为300 mg/L的二氯异氰尿酸钠溶液作用20 min可完全灭活伪狂犬病病毒，而在37 ℃环境下有效氯为300 mg/L的二氯异氰尿酸钠溶液作用10 min即可完全灭活伪狂犬病病毒，在4 ℃环境下有效氯为300 mg/L的二氯异氰尿酸钠溶液作用40 min仍未完全灭活伪狂犬病病毒，表明该消毒剂对病毒的灭活效果受温度影响。

表2 碘酸混合溶液对伪狂犬病病毒灭活效果

表3 二氯异氰尿酸钠溶液对伪狂犬病病毒灭活效果

3 讨论

目前市场所售的兽用消毒剂可分为卤素类消毒剂、氧化剂类消毒剂、醛类消毒剂、醇类、酚类消毒剂、酸碱类消毒剂和表面活性剂类消毒剂等多种类型的消毒剂[7]，其中以卤素类、醛类和酸碱类消毒剂最为常用。本研究选用养殖场常用的3种三类兽用消毒剂，并分别评估了其对伪狂犬病病毒的灭活效果。

戊二醛癸甲溴铵溶液是一种新型复方消毒剂，癸甲溴铵为双链季铵盐消毒剂，其季铵阳离子与病原体胞浆膜磷脂中带负电荷的磷酸基结合，使其通透性改变，此外其对亲脂性病毒也有一定作用,可协同戊二醛更易进入病毒内部，破坏蛋白质和酶活性，溴离子使分子的亲水性和亲脂性增强，达到快速高效的消毒作用[8]。本研究发现，在常温和37 ℃下0.2%的戊二醛癸甲溴铵溶液作用5 min可将伪狂犬病病毒完全灭活，这与说明书推荐的在疫情发生时所用消毒浓度(0.1%-0.2%)相符。而在低温环境下，作用30 min仍未将病毒灭活，表明该消毒剂消毒效果受到环境影响较大，应引起重视。研究显示该消毒剂对不同种类病毒的灭活效果存在差异。有研究显示常温下浓度为0.01%的戊二醛癸甲溴铵溶液作用20 min可在体外完全杀灭猪繁殖与呼吸综合征病毒[9]，0.1%戊二醛癸甲溴铵溶液作用30 min可将H7N9亚型流感病毒完全灭活[10]，而本研究显示0.1%的戊二醛癸甲溴铵溶液作用30 min却不能完全灭活伪狂犬病病毒，表明针对不同病原体应选择合理的作用浓度，必要时需增加消毒剂的浓度。

二氯异氰尿酸钠由于杀菌消毒能力强，毒性低和稳定性高，目前已广泛使用于养殖业。其主要作用原理为使病原体蛋白质变性，改变膜通透性，干扰酶系统生理生化及影响DNA合成等过程，使病原体死亡。研究显示该消毒剂对不同病毒的灭菌效果存在着差异，有效氯浓度为100 mg/L的二氯异氰尿酸钠作用10 min可完全灭活猪圆环病毒2型[11]，有效氯浓度为25 mg/L的二氯异氰尿酸钠作用10 min即可完全灭活猪粘病毒[12]，本研究显示在常温下有效氯为300 mg/L的二氯异氰尿酸钠作用30 min方可完全灭活伪狂犬病病毒。研究显示常温下有效氯为200 mg/L的二氯异氰尿酸钠作用10 min对伪狂犬病病毒灭活率大于99.99%，与生产商疫源地消毒推荐浓度为200 mg/L相符。但在4 ℃环境下有效氯为200 mg/L的二氯异氰尿酸钠作用10 min对伪狂犬病病毒的灭活率只有99.98%。按照国内消毒剂检测规定，用杀灭率来表示消毒效果时，消毒剂对病毒杀灭率须大于99.99%才为消毒合格，应引起重视。本试验中的病毒是完全浸泡在一定浓度下的消毒剂中，与实际应用环境有所差别，为确保消毒效果在低温状况下应适当增加二氯异氰尿酸钠的浓度。因此，在低温环境下对存在伪狂犬病病毒等抵抗力较强的病原体的疫源地消毒时推荐使用有效氯为400 mg/L的二氯异氰尿酸钠溶液。

碘酸混合液主要通过碘化和氯化酶体蛋白活性基团，并与蛋白的氨基结合而导致蛋白变性和抑制菌体的代谢酶系统。本研究显示按说明书推荐浓度使用1：300倍稀释使用时，在低温和常温下均可迅速灭活猪伪狂犬病病毒，具有良好灭活效果,但在1：100和1：200倍稀释的状况下对细胞的毒性较大，接种消毒剂与病毒混合液后，细胞易脱落和凋亡,难以观察病毒感染细胞的状况，从理论上浓度高的消毒剂更易灭活病原体，但在对活体皮肤等消毒时应引起重视，避免应激反应的发生。

本研究结果为实验条件下得出的结果，在养殖业实际使用过程中由于受粪便等有机物的干扰，其消毒效果可能有所降低。因此，在养殖场进行消毒前应先进行清扫和冲洗，减少有机物的干扰以提高消毒剂对病原微生物的灭活作用，并且在冬季等低温天气应适当提高消毒剂浓度和作用时间。