三种商用有机肥中抗生素的污染特征及农用生态风险评价

周海伦，操家顺，3，罗景阳，3，孙艺雯

(1.河海大学 浅水湖泊综合治理与资源开发教育部重点实验室，江苏 南京 210098；2.河海大学 环境学院，江苏 南京 210098；3.国河环境研究院(南京)有限公司，江苏 南京 211599)

随着中国畜禽养殖业的快速发展，预计2030 年畜禽粪便产量将达到37.43亿t。将畜禽粪便进行肥料化利用既可以解决畜禽粪便污染，又可以回收N、P、K资源[1]，但粪肥的施用也会导致残存的抗生素进入土壤[2-3]，对土壤生态造成危害。已有研究主要探讨养殖场周边[4]、粪肥施用后的土壤中抗生素含量[5]，但有机肥中抗生素残留情况研究较少。

本文参照《食品安全国家标准——食品中兽药最大残留量》(GB 31650—2019)标准，选取了30种在动物体内残留量较高的抗生素进行检测。

以湖北省某畜禽粪污处理中心为例，检测了厌氧发酵、好氧堆肥、干化炭化工艺制备的三种商用有机肥料，分析其抗生素污染特征，并进行生态风险评估，为后续的还田利用提供参考依据。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

30种抗生素标准品(包括4种四环素类(TCs)：Doxycycline(DOC)，Tetracycline(TC)，Oxytetracycline(OTC)，Chlortetracycline(CTC)；5种大环内酯类(MLs)：Lincomycin(LIN)，Roxithromycin(RTM)，Azithromycin(AZI)，Erythromycin(ETM)，Tylosin tartrate(TYL)；8种磺胺类(SAs)：Trimethoprim(TMP)，Sulfamonomethoxine(SMM)，Sulfamethoxaz(SMT)，Sulfaquinoxaline(SQX)，Sulfamethazine(SMZ)，Sulfacetamide(STM)，Sulfadimethoxine(SMX)，Sulfadiazine(SDZ)；7种氟喹诺酮类(FQs)：Ofloxacin(OFC)，Norfloxacin(NFC)，Ciprofloxacin(CIP)，Difloxacin(INN)；4种抗真菌类(β-lactams)：Miconazole(MCZ)，N4-Acetyl-Sulfamethoxazole(NAST)，Ketoconazole(KTC)，Fluconazole(FLE)；2种氯霉素类(CAPs)：Thiamphenicol(TAP)，Sulfathiazole(ST))均购于中国阿拉丁公司；甲酸、乙腈、氢氧化铵均为色谱纯；甲醇、柠檬酸、丙酮、NaH2PO4、Na2EDTA、NaOH均为分析纯。

ACQUITY UPLC Xevo TQ型高效液相色谱-三重四极杆质谱仪(配备ACQUITY BEH C18色谱柱)；AUTOTRACE 280型固相萃取仪(配备HLB固相萃取柱)；MZY-UCR10V型超纯水仪；SX2-4-10Z型烘干机；XZ-16T型台式离心机；ALPHA1-2LD PLUS型冻干机；SCILOGEX MX-S型旋涡混匀器；SCQ-6201C型超声波清洗机等。

1.2 样品采集

样品采自湖北省某畜禽粪便资源化处理中心，所处理粪污覆盖7个乡镇的规模化养殖场共计 102万头生猪、500万羽家禽、6万头牛，总计年产150万t。资源化处理中心的畜禽粪污全量化利用制备有机肥的方式为好氧处理、干化炭化、厌氧发酵三种，可分别制备有机肥、炭基肥、液肥三种商用有机肥料。样品按固态和液态分类采集，每个取样点重复取样3次，每次取样200 mL，混合后，分为2份平行样本，共计36个样品(24个固态样品，12个液态样品)，所有样品取样后-4 ℃保存[6-7]。

图1 畜禽粪污处理流程和取样点Fig.1 Treatment processes of livestock manureand sampling points

1.3 分析方法

1.3.1 样品处理 固体样品经冻干机冷冻干燥，研磨后过40目筛网。分别称取1 g粪便样品，用 10 mL 柠檬酸酸化、乙腈提取，在漩涡混匀器上 2 500 r/min 混匀10 s，25 ℃超声15 min，然后在 4 ℃，4 500 r/min条件下离心15 min，重复提取 1次，收集上清液，通过聚四氟乙烯过滤膜，氮气吹近干，用100 mL超纯水稀释，通过0.7 μm玻璃纤维过滤膜，待进入固相萃取仪。液体样品离心后(9 000 r/min，3 min)取上清液5 mL，用甲酸/乙腈初始流动相稀释200～500倍，过0.22 μm亲水性玻璃纤维膜后保留滤液，无需萃取，置于-4 ℃避光保存，以待上机。

1.3.2 色谱条件和质谱条件 所有样品均采用电喷雾正离子(ESI+)和电喷雾负离子模式(ESI-)下操作的Water LC-MS/MS进行分析。每个样品进样量为5 μL。流动相为氢氧化铵(溶剂A)和乙腈(溶剂B)，流速为200 μL/min。浓度梯度(时间(min)，A%和B%曲线)的程序如下：(0，90/10)，(0.25，90/10)，(3，10/90)，(4，10/90)，(4.01，90/10)和(5，90/10)。其他色谱和质谱参数参考已有文献[8-9]，毛细管电压保持在3 000 V。

1.3.3 回收率实验 在1 g干燥的空白样品中，分别添加5 μg/L的四环素类抗生素混合标准溶液20，100，400 μL，对应的添加浓度分别为0.1，0.5，2 mg/kg，混匀稳定10 min后，后续步骤与预处理步骤相同，上机测定[10]。每个加标浓度水平各平行3次实验进行测定，经计算本次实验加标样品中目标抗生素的回收率为65.4%～105.9%，标准曲线的线性相关系数(R2)均大于0.997。

1.4 生态风险评估

1.4.1 生态风险评估方法 风险商值法(RQ)是环境中污染物生态风险评估的主要方法之一，已被广泛用于评估土壤环境中抗生素潜在生态风险的大小。抗生素的RQ值由下式计算：

RQ=MEC/PNEC

(1)

式中，MEC为土壤中预测的抗生素浓度；PNEC为抗生素抗性选择的预测无影响浓度，根据RQ值可以分为3个污染等级：0.01≤RQ<0.1，为低风险；0.1≤RQ<1，为中风险；RQ≥1，为高风险[11]。抗生素的毒理性数据可直接在美国环保署EPA ECTOX数据库中查找，土壤的毒理性数据缺失时使用淡水中数据和水-土壤分配系数进行折算[12-13]。计算方法如下：

PNECwater=EC50/AF

(2)

PNECsoil=PNECwater×Kdsoil

(3)

式中PNECwater——淡水中抗生素抗性选择的无效应浓度，μg/L；

PNECsoil——土壤中抗生素抗性选择的无效应浓度，μg/kg；

Kdsoil——土壤-水的分配系数，L/kg，为了最大化估计土壤中抗生素的影响，选择现有研究中土壤类型相近的最低PNECsoil进行估计[14]；

EC50——急性毒性参考因子，半最大效应浓度，mg/L；

AF——评估因子，考虑到目标抗生素毒性数据都具有短期试验，故AF取值1 000[15]。

1.4.2 抗生素浓度计算方法 粪便中的抗生素向土壤迁移的过程十分复杂[16]，故本研究在已知三种有机肥料抗生素浓度的基础上，按照欧盟公布的评估兽药环境风险的新指南(VM)适当调整后，对有机肥施用后的土壤中抗生素浓度进行预测。首先按作物生长需求量计算可施用于土地的最大肥量[17]，其次检测出有机肥中抗生素浓度，再计算施用有机肥后犁过的土壤中抗生素浓度[18]。为了以最坏情况计算，预测浓度不考虑随气候变化、农业活动导致的部分抗生素降解或迁移，将犁过土壤中抗生素浓度作为MEC值代入式(1)进行生态风险商值的计算。

2 结果与讨论

2.1 畜禽粪便初始抗生素残留情况

6大类30种抗生素的检测结果见表1。

表1 样品中抗生素检出率及浓度均值Table 1 Detection types and average concentrations of antibiotics in samples

由表1可知，采集的样本中，6大类抗生素均有效检出。在未经处理的粪污中共检出抗生素19种，检出种类以四环素类TCs、喹诺酮类FQs、大环内酯类MLs及磺胺类SAs为主，四大类抗生素ΣTCs、ΣFQs、ΣMLs、ΣSAs浓度均值分别为 1 472.91，28.62，1.87，3.3 μg/kg(干基)，与胡献刚等检测的猪粪中各类抗生素相比四环素类的平均浓度偏高[8]，土霉素最高值达3 626.9 μg/kg(干基)。检出浓度最高的4种畜禽粪便中的抗生素分别为土霉素、金霉素、四环素、强力霉素，皆属四环素类(浓度≥450 μg/kg(干基))。

4种四环素类抗生素强力霉素、四环素、土霉素、金霉素在12份固态样品中检出率皆为100%，喹诺酮类抗生素检出种类最多，共检出7种，按检出率高低，分别为氧氟沙星=诺氟沙星=恩诺沙星>洛美沙星>氟罗沙星>环丙沙星>双氟沙星。检出率越高，代表该抗生素在粪便处理过程中的持久性越强，越不易降解。

大环内酯类有效检出林可霉素、罗红霉素和阿奇霉素3种，抗真菌类和氯霉素类各有效检出一种分别为咪康唑和甲砜霉素，以上三类抗生素中浓度最高的仅为3.3 μg/kg(干基)，可见不同种类的抗生素残留浓度之间存在着超过3个数量级的差距，可能原因：一是抗生素在动物体内的代谢程度不同而导致排出体外的抗生素残余量差异较大；二是在畜禽养殖过程中不同抗生素的使用量会根据生长周期、季节的变化而有所波动。

2.2 固态有机肥抗生素残留情况

固态粪便资源化方式分为好氧堆肥处理和干化炭化处理，分别制备有机肥(CP)和炭基肥(CBOF)，各工艺阶段抗生素残留情况见图2。

图2 四类主要检出抗生素在好氧堆肥和干化炭化过程中的浓度变化Fig.2 Concentration changes of major detected antibioticsduring composting and carbonizationa.四环素类(TCs)；b.喹诺酮类(FQs)；c.大环内酯类(MLs)；d.磺胺类(SAs)

由图2可知，有机固态肥料制备过程中各类抗生素总量呈波动式下降趋势，脱水及固液分离环节对固态畜禽粪便中的TCs去除率为21.6%～57.4%，对FQs去除率达94.0%～96.4%。经过预处理后，固态粪污分为堆肥和炭化两种处理方式，分别制备CP和CBOF。为调节水分含量，畜禽粪便在堆肥和炭化前与木屑等物料进行混合。除MLs外，所有抗生素浓度都因水分的极速变化而迅速降低30%～68%。

堆肥处理后，抗生素种类由19种减至8种，四类主要抗生素ΣTCs、ΣFQs、ΣMLs、ΣSAs浓度平均值分别为47.28，2.73，6.25，0.38 μg/kg(干基)，OTC浓度依然最高，为285.15 μg/kg(干基)。除了SMM和TMP去除率不足90%，其余抗生素去除率普遍达95%。堆肥处理对四环素类和喹诺酮类抗生素的去除效果较好，去除率为90%～95%，因为TCs和FQs对生物降解十分敏感。但MLs和SAs经过预处理后浓度升高，这是由于固液分离后的粪污总量大大减少，导致抗生素在固相中的富集。堆肥中的MLs和SAs在处理前后出现的负去除情况可能是由于处理周期较长，进料与出料非同一批次粪污，原料抗生素浓度本就有差异，故检测结果作为粪污和有机肥中残留的抗生素定性研究有较高参考价值，若作为定量研究需要进一步取样测试。

干化炭化对喹诺酮类、大环内酯类、磺胺类抗生素几乎100%去除，残留的抗生素浓度总残留量小于1 mg/kg，但对四环素类抗生素去除率仅为72%～88%。与堆肥处理相比，干化炭化对抗生素的总去除率高20%～30%，主要原因是绝大部分抗生素都有环状结构和羰基、羟基和氨基等活泼基团，不具备热稳定性。堆肥温度最高在70～80 ℃，而炭化炉中温度为400 ℃，持续高温加热使抗生素的分子结构或基团更易被破坏。

2.3 液态有机肥抗生素残留情况

由图3可知，液肥(LOF)处理过程中，厌氧池对四环素、土霉素的去除效果较好，但对林可霉素、磺胺间甲氧嘧啶、恩诺沙星的去除率皆低于15%，对金霉素出现了负去除的情况；而初沉池对各类抗生素的去除效果不佳，多数出现了负去除，原因可能是液肥在沉淀池中最长停留30 d，有一定的浓度富集情况。

图3 液肥处理过程中主要抗生素浓度Fig.3 Concentration changes of major detected antibioticsduring the liquid organic fertilizer

液态畜禽粪便处理前检测出的初始抗生素为8种，不足粪便原料抗生素种类的1/2，与固态畜禽粪便相比TCs未检出强力霉素，FQs未检出氟罗沙星、诺氟沙星、环丙沙星；MLs未检出罗红霉素、阿奇霉素；SAs未检测出磺胺二甲基嘧啶和甲氧苄啶。虽然这些抗生素都具有水解稳定性，但对固态粪便表现出更强的吸附亲和力，故在液态粪便中未能达到检出限。处理后的液肥中仍包含3中抗生素残留，残留浓度最高的依然是金霉素和林可霉素，浓度分别为341.86，147.12 mg/L，占液肥残留抗生素总量的98%。金霉素和林可霉素在猪的保育、育成育肥、哺乳、妊娠阶段的呼吸道、软组织感染的预防和治疗都有大量使用；特别是林可霉素使用量在中国兽用药中排名第三，除此之外这两种抗生素在盐溶液中的溶解性强且不易发生水解，在水中具有持久性，是液肥后续处理中需要关注的主要目标。

2.4 三种有机肥处理过程中抗生素残留情况的比较

三种有机肥处理过程中抗生素残留浓度和去除率见表2。

表2 三种有机肥中抗生素的残留浓度和去除率Table 2 Residue concentration and removal rate of antibiotics in three kinds of org-fertilizer

由表2可知，三种有机肥中每一种高残留抗生素都是四环素类，尤其是OTC，这也是粪便样品中检测到的最高浓度，显示了畜禽饲养过程中四环素类的使用范围广、用量大。除OTC的残留水平高于其他研究外[19]，TC和CTC的残留水平与其他研究中大致相同。

在本研究中，堆肥、炭化和厌氧处理对抗生素有不同的去除机理，三种处理的平均去除率分别为 86.85%，96.35%和61.38%，抗生素残留浓度为畜禽粪便(1.87～1 472.91 μg/kg干重)>LOF(147.12～341.86 mg/L)>CP(0.38～47.27 μg/kg干重)>CBOF(0.05～1.41 μg/kg干重)。由此可知：①TCs是堆肥、炭基肥和液肥的主要残留抗生素；②TCs、FQs和SAs更容易留在固相中，脱水处理是去除粪便固体部分TCs和FQs的决定性因素；③高浓度残留代表该类抗生素在动物养殖过程中的使用较多，且处理过程不易降解。

2.5 有机肥料农用的生态风险评估

以农业部公布的《畜禽粪污土地承载力测算技术指南》中关于区域植物养分需求量和猪当量粪肥养分供给量作为参考依据，在美国环保署EPA ECTOX数据库中查找相关毒理学数据(表3)，并计算得出三种有机肥残留浓度的风险熵值见图4。

由图4可知，炭基肥和堆肥中所有抗生素的风险可接受，熵值<0.1；液肥中金霉素具有中风险，其次林可霉素风险较高，达0.04，液态肥料的安全性低于固态肥料，其农用的潜在风险更大。然而，就有机肥施用的特点来看，此处的结果为肥料施用后到达浅层土壤的即时浓度，浓度水平为mg/kg级。随着时间的迁移和降雨影响，土壤中抗生素浓度会进一步下降，生态风险也随之降低。除此之外，抗生素对植物、土壤动物与微生物的毒理效应还受土壤的理化性质等影响[20]。虽然有机肥中的抗生素向土壤环境中迁移量有限[21]，但考虑到抗生素的降解周期长，代谢产物同样具有毒性的特点，长时间的有机肥施用仍需要慎重考虑。

表3 检出抗生素急性毒性数据及土壤分配系数Table 3 Acute toxicity data and soil distribution coefficient of antibiotics detected

图4 三种有机肥中抗生素生态风险熵值

3 结论

在好氧堆肥、干化炭化、厌氧发酵三种方式制备的有机肥、炭基材料、液肥中，抗生素残留含量最高的分别为土霉素285.15 μg/kg(干基)、环丙沙星 2.38 μg/kg(干基)、金霉素341.86 mg/L，就去除率而言，炭化处理>好氧堆肥>厌氧发酵。

急性毒理学数据表明，三种有机肥料中抗生素对土壤环境的危害：液肥>堆肥>炭基肥，这与三种肥料制备工艺对抗生素去除效果一致，故抗生素残留浓度与其对应的生态风险具有正相关性。抗生素在土壤中的毒理性数据仍有较多的缺失，毒性数据多来源于水生植物或动物，对各类农作物种子及幼苗的毒性仍不明晰，需要进一步探究。