醒脑静联合纳洛酮对急性酒精性昏迷大鼠的促醒作用研究

余柳燕 雷 娜 解宇环 郭沛鑫

云南中医药大学，云南 昆明 650500

急性酒精中毒是指机体短期内摄入过量乙醇，导致中枢神经系统出现先兴奋后抑制的状态[1]。在临床接诊中，急性酒精中毒的接诊率高达67.08%，根据中枢神经系统损伤程度将其分为兴奋期、共济失调期及昏迷期[2-3]。流行病学调查[4]结果显示，酒精性昏迷已成为昏迷发生的三大主因之一。急性酒精性昏迷是酒精中毒的重度阶段，如何快速有效地对昏迷患者进行促醒治疗并减轻并发症，改善预后是临床急诊医学关注的重点。

醒脑静注射液是经典方安宫牛黄丸基础上缩减而来，由栀子、冰片、麝香、郁金四味药组成，栀子性寒味苦，有清热解毒之功，现代药理研究[5]发现，栀子苷具有抗炎、解热、利胆的作用 ；冰片引药上行，主通窍散郁，可增强中枢的缺氧耐受力[6]；麝香芳香走窜，可开窍醒神，麝香酮可兴奋中枢神经系统及呼吸系统，增强脑血流，保护神经元[7]；郁金则行气止痛，清心解郁，可降低血浆β-EP水平，减轻氧化应激反应引起的器官损害[8]。临床上常用醒脑静注射液治疗脑血管疾病、脑外伤、急性中毒、病毒感染引起的昏迷[9]。研究[10]发现，单用醒脑静在治疗急性酒精中毒时，其发挥的疗效和纳洛酮相近，且临床应用安全，不良反应少。与纳洛酮联合应用治疗急性酒精中毒的患者时，疗效肯定，但作用机制不明确。

研究[11]发现，过量乙醇摄入会导致认知功能障碍与脑结构损伤，乙醇对啮齿类动物的影响主要是破坏空间记忆能力。另外，研究[12]证实了乙醇可通过诱导氧化应激及神经炎性反应等途径导致学习记忆功能障碍。目前临床治疗急性酒精性昏迷，疗效明确、使用频率较高的是阿片受体拮抗类药物。此外，常用中药注射液有醒脑静、清开灵等。基础研究[13]发现，单用纳洛酮时，对应激状态下亚急性酒精中毒大鼠学习记忆损害有一定的改善作用；在临床研究中，常用纳洛酮联合醒脑静治疗昏迷患者[14-15]，但联合用药与二药单独应用的疗效对比及对认知功能改善有何异同，尚无相关实验研究。该研究的缺乏极大地局限了联合用药的推广和应用。本研究拟采用腹腔注射乙醇溶液的方式建立急性酒精性昏迷大鼠模型，通过观察醒脑静与纳洛酮单用和二者联合用药时各组大鼠昏迷评分变化，RCS评分可反映大鼠昏迷程度，RCS评分越低，大鼠昏迷程度越深。明确促醒的作用，并利用水迷宫观察大鼠逃避潜伏期、穿越平台次数及目标象限停留所占百分比等记忆功能的变化，以此来评价二药联用时促醒作用的特点，可为临床用药提供实验支持。

1 实验材料

1.1 药物 醒脑静注射液(批号：2106042)，购于大理药业股份有限公司；盐酸纳络酮注射液(批号：2010015)，购于山东新华制药股份有限公司。根据临床人用剂量，按照人与大鼠体表面积折算法，分别将盐酸纳络酮和醒脑静注射液用生理盐水配制为0.2 mg/mL与5.48 mg/mL浓度，置于4 ℃冰箱备用。

1.2 实验动物 SPF级雄性SD大鼠，体质量(200±20)g，购于北京斯贝福实验动物有限公司，许可证号：SCXK(京)2019-0010。于云南中医药大学SPF级实验动物中心饲养，温度(22±2)℃，相对湿度为40%～55%，室内光暗循环12 h，自由饮水，进食。

1.3 试剂 无水乙醇(批号：20211001420)，购于天津市致远化学试剂有限公司；生理盐水(批号：210326 2B)，购于西安京西双鹤药业有限公司。

1.4 仪器 DB001型Morris水迷宫，北京智鼠多宝股份有限公司生产；BCD-392MNE型4 ℃冰箱，由青岛海尔股份有限公司生产。

2 方法

2.1 急性酒精性昏迷大鼠乙醇造模浓度摸索 取健康SD雄性大鼠24只，随机分为32%、34%、52% 3个乙醇浓度组，每组8只动物，分别腹腔注射上述不同浓度乙醇，注射容积为16 mL/kg，观察造模后大鼠的耐受性和昏迷程度，参照由格拉斯哥昏迷评分量表(glasgow coma scale， GCS)改良的大鼠昏迷评分量表(表1)进行昏迷程度评分。评分内容包括眼睑刺激反应、脑干反射、翻正反射、听觉刺激以及胡须运动等方面，评分为0～3分时判断大鼠进入昏迷状态;评分为10～13分时判断大鼠为清醒状态。选择合适的乙醇浓度进一步考察给药容积。

表1 大鼠昏迷评分量表(RCS)

2.2 急性酒精性昏迷大鼠乙醇造模体积摸索 根据上述实验中的结果确定的乙醇造模浓度，取健康SD雄性大鼠24只，分别用15 mL/kg、16 mL/kg、17.8 mL/kg乙醇溶液腹腔注射后，对翻正反射消失的大鼠同法参照表1大鼠昏迷评分量表(RCS)进行昏迷程度评分。每只动物持续观察300 min，每隔30 min进行昏迷评分1次，记录大鼠的昏迷时长及昏迷程度。

2.3 醒脑静联合纳洛酮对急性酒精性昏迷大鼠的促醒作用研究 取健康雄性SD大鼠40只，适应性喂养5 d后，随机分为5组，分别为空白组、模型组、醒脑静注射液组(20 mL/kg)、盐酸纳络酮注射液组(0.9 mL/kg)及醒脑静联合纳洛酮注射液组(20 mL/kg+0.9 mL/kg)，每组6只，除空白对照组外，其余各组采用32%乙醇以17.8 mL/kg剂量腹腔注射，复制急性酒精中毒昏迷大鼠模型，造模后随即于另一侧腹腔注射给药。在造模给药后，采用RCS表(表1)对各组大鼠进行昏迷评分。每隔30 min进行一次评分，评分直到第5 h，动物基本苏醒后，停止评分。

2.4 大鼠Morris 水迷宫实验(MWM) 取健康雄性SD大鼠50只，适应性喂养结束后，进行水迷宫实验，水迷宫直径1.6 m，高50 cm，水面没过平台(直径20 cm)1 cm左右，水深30 cm，水温(25±1)℃。大鼠造模前对大鼠进行为期5 d的定位航向训练，将大鼠依次从四个象限放入水中，若90 S后还未找到平台，便引导大鼠进入平台，停留10 S，若90 S内找到平台，则进行下一只鼠的训练。训练第6天，动物同法分组、造模、给药，在给药后第12 h，进行探查训练。撤去平台，记录大鼠进入平台的时间、进入次数及目标象限停留时间所占百分比。实验装置如图1所示。

图1 Morris水迷宫图

3 结果

3.1 急性酒精性昏迷大鼠乙醇造模浓度摸索 实验结果发现，34%与52%浓度乙醇给大鼠腹腔注射后均出现动物死亡，死亡率分别为12.5%和75%，32%乙醇腹腔注射，动物均出现翻正反射消失，但未见动物死亡。因此，本研究选择32%浓度乙醇作为急性酒精性昏迷大鼠的乙醇造模浓度。实验结果见表2。

表2 不同浓度乙醇对大鼠死亡率的影响>

3.2 急性酒精性昏迷大鼠乙醇造模体积摸索 实验结果表明，采用32%的乙醇溶液，以17.8 mL/kg腹腔注射造模，大鼠昏迷评分最低，部分大鼠在造模3 h后翻正反射开始恢复，在造模后5 h，大鼠基本恢复清醒，较符合急性酒精昏迷的临床表现。后续正式实验选用该浓度和体积的乙醇溶液复制急性酒精中毒昏迷大鼠模型。结果见表3、图2。

表3 不同给药体积对大鼠昏迷评分及昏迷时长的影响

3.3 醒脑静联合纳洛酮对急性酒精性昏迷大鼠的促醒作用研究 实验结果表明，32%乙醇造模后，0 h时各组大鼠RCS评分在2.5～3分之间，随着时间推移，评分逐渐升高，造模4.5 h后，模型组大鼠RCS评分恢复至正常大鼠水平。

注:与15 mL/kg组比较，**P<0.01

与模型组比较，纳洛酮组在造模1.5 h、2 h、2.5 h、3 h、3.5 h、4 h、4.5 h后评分明显增高(P<0.05，P<0.01)，醒脑静组在造模1 h、1.5 h、2 h、2.5 h、3 h、3.5 h、4 h后，评分明显增高(P<0.05，P<0.01)，醒脑静联合纳洛酮用药组动物苏醒较快，在造模给药后0.5 h、1 h、1.5 h、2 h、2.5 h、3 h、3.5 h、4 h评分明显增高(P<0.05，P<0.01)。与纳洛酮组比较，联合用药组及单用醒脑静组大鼠恢复清醒时间较纳洛酮组提前了1 h(评分≥10)，联合用药组疗效略优于单用醒脑静组。

实验结果表明，醒脑静与纳络酮联合用药，对急性酒精性昏迷大鼠的促醒作用优于醒脑静和纳络酮单独用药。结果见表4。

3.4 大鼠Morris 水迷宫实验(MWM) 实验结果显示，与空白组比较，模型组大鼠逃避潜伏期明显延长(P<0.01)，穿越平台次数及目标象限停留时间明显减少(P<0.01)；与模型组比较，醒脑静组、醒脑静+纳络酮联合用药组逃避潜伏期明显缩短(P<0.01)，目标象限停留百分比明显增加(P<0.01)，醒脑静组、纳洛酮组、醒脑静+纳络酮联合用药组大鼠穿越平台次数明显增加(P<0.05，P<0.01)。与纳洛酮相比较，联合用药组及醒脑静组大鼠逃避潜伏期明显减少(P<0.01)，目标象限停留百分比明显增加(P<0.01)，联合用药组穿越平台次数明显增加(P<0.01)。实验结果提示，醒脑静联合纳洛酮用药，对急性酒精性昏迷大鼠的学习记忆功能障碍改善明显优于醒脑静和纳络酮单独用药。结果如图3、图4所示。

表4 醒脑静联合纳洛酮对急性酒精性昏迷大鼠的促醒作用研究

注:与空白组比较，**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01；与纳洛酮组比较，&&P<0.01。图3 大鼠逃避潜伏期、穿越平台次数及目标象限停留所占百分比的影响图

图4 大鼠水迷宫轨迹图

4 讨论

现代药理研究[16]发现，醒脑静注射液可通过调节觉醒肽-腺苷神经功能促进酒精昏迷大鼠觉醒。纳络酮为阿片类受体拮抗药，其促醒机制与药物取代β-EP与吗啡受体结合，解除其对中枢神经系统的抑制状态有关[17]。临床上常用醒脑静联合纳洛酮治疗急性酒精中毒导致的昏迷，疗效肯定，但作用机制不明确。

本研究先运用在格拉斯哥昏迷评分量表(GCS)基础上改良得来的大鼠昏迷评分量表(RCS)对酒精中毒大鼠昏迷程度进行评价，评分越低，表明大鼠昏迷程度越深，连续时间内测评，可动态反映大鼠昏迷程度变化。经过预实验证实，32%的乙醇以17.8 mL/kg给大鼠腹腔注射，大鼠昏迷评分在0～3分内，昏迷时长为(3±0.5)h，且无动物死亡，与临床急性酒精中毒昏迷的临床表现一致性较好，故选择该剂量酒精可快速且安全的复制大鼠昏迷模型。

Morris水迷宫是作为啮齿类动物空间学习与记忆的经典行为学实验方法，通过强迫实验动物(如大鼠、小鼠)游泳，学习寻找目标象限隐藏平台，可测试实验动物对空间位置及空间定位的学习及记忆能力，在学习记忆机制[18]、药物开发及阿尔茨海默症、血管性痴呆、帕金森及脑外伤等各类疾病模型[19～20]的评价中被广泛应用。该系统主要由定位航向实验与空间探索实验两部分组成。其中逃避潜伏期、穿越平台次数及目标象限停留百分比等常作为评价其空间探索能力的指标。本研究选用了Morris水迷宫中的空间探索行为学指标评价醒脑静联合纳洛酮对昏迷恢复后大鼠的记忆功能的改善作用。实验结果表明，酒精中毒昏迷大鼠苏醒后，逃避潜伏期明显延长，穿越平台次数与目标象限停留百分比减少，而联合用药对大鼠逃避潜伏期、穿越平台次数、目标象限停留所占百分比均优于单用醒脑静或纳洛酮组，提示联合用药可改善急性乙醇导致的大鼠学习记忆功能下降。

本实验以32%乙醇17.8 mL/kg腹腔注射建立急性酒精中毒昏迷大鼠为研究对象，实验结果表明，醒脑静、纳洛酮及二者联合用药均可提高大鼠昏迷评分，单用醒脑静作用略优于单用纳洛酮，二者联用时，昏迷评分最高，表明醒脑静联合纳洛酮可明显缩短大鼠昏迷时长，改善机体意识与运动功能障碍，疗效优于单用醒脑静和单用纳络酮；酒精中毒昏迷大鼠苏醒后，逃避潜伏期明显延长，穿越平台次数与目标象限停留百分比减少，而联合用药对大鼠逃避潜伏期、穿越平台次数、目标象限停留所占百分比均优于单用醒脑静或纳洛酮组，提示联合用药可改善急性乙醇导致的大鼠学习记忆功能下降。

因此，醒脑静、纳洛酮、二者联合用药均可不同程度发挥促醒作用，其中联合用药促醒效果最佳，醒脑静组在改善大鼠昏迷评分及记忆功能方面均优于单用纳洛酮，为进一步明确单独用药与联合用药各自发挥促醒作用的机制，后续将进一步开展药物促醒作用的机制研究。