苦豆子总碱对大鼠慢性酒精性肝损伤的保护作用研究

张 东 董佳妮 谢华祎 康松松 邬国栋*

1.内蒙古科技大学包头医学院基础医学与法医学院，内蒙古 包头 014040；2.内蒙古科技大学包头医学院药学院，内蒙古 包头 014040

1965年，Lieber和他的同事的开创性工作证实了酒精的肝毒性作用[1]。在大多数工业化国家中，酒精是继丙型肝炎之后最常见的慢性肝病病因[2]。酒精性肝病包括一系列疾病，如单纯性脂肪变性、脂肪性肝炎、肝硬化和晚期肝细胞癌等[3]。酒精性肝病的预防及治疗是迫切需要解决的问题。

苦豆子(SophoraalopecuroidesL.)系豆科(Leguminosae)槐属植物，药用部位可以是全草，也可以是根及种子，是一种常用的中蒙药材，主要成分有生物碱、黄酮和挥发油等，其中生物碱是其重要活性成分，本文称为苦豆子总碱(total alkaloids of sophora alopecuroides，TASA)[4]。在我国，主要分布于内蒙古、宁夏、新疆、甘肃、青海、西藏等地区，分布范围较广[5]。TASA具有抗炎、抗癌、抗菌和免疫调节等作用[6-8]。黄华等[9]研究发现苦豆子总碱对化学性肝损伤模型(如四氯化碳和D半乳糖氨所引起的)和免疫性肝损伤模型(卡介苗加脂多糖引起)具有保护作用，可使ALT和AST水平下降。本实验拟应用56%乙醇制备大鼠慢性酒精性肝损伤模型，从不同角度探讨TASA对大鼠慢性酒精性肝损伤是否具有保护作用及其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 Wistar雄性大鼠，体重200～220 g，从斯贝福(北京)生物技术有限公司购买，合格证号：SCXK(京)2016-0002。

1.1.2 药品与试剂 苦豆子总碱(西安立森生物科技有限公司，含量为80%，批号20191107)；联苯双酯(万邦德制药集团股份有限公司，生产批号：A02J181109)；红星二锅头(56°)(北京红星股份有限公司，生产批号：0955101120180219)。谷丙转氨酶(ALT，生产批号：20191106)试剂盒、谷草转氨酶(AST，生产批号：20191105)试剂盒、丙二醛(MDA，生产批号：20191108)试剂盒、超氧化物酶(SOD，生产批号：20191013)均购自南京建成生物工程研究所。白细胞介素6测定试剂盒(IL-6，生产批号：20191012),肿瘤坏死因子α测定试剂盒(TNF-α，生产批号：20191012)，购自中生北控生物科技股份有限公司。转化生长因子β1试剂盒(TGF-β1，生产批号：E-30634)，购自北京奥维亚生物技术有限公司。γ干扰素试剂盒(IFN-γ，批号：20190803)，购自北京华英生物技术研究所。

1.1.3 主要仪器 AU640全自动生化分析仪( 日本奥林巴斯公司)，MultiSkan3酶标仪(赛默飞世尔科技有限责任公司)，Sartorius BSA224S-CW电子天平(北京赛多利斯科学仪器有限公司)，TDZ5—WS多管架自动平衡离心机(长沙湘仪离心机仪器有限公司)。

1.2 给药方案与模型制备 48只大鼠随机分为6组，分别是空白组，模型组，联苯双酯组2.4 mg·kg-1，苦豆子总碱14 mg·kg-1、28 mg·kg-1和56 mg·kg-1组，每组8只。空白组和模型组给予蒸馏水，其它组给予相应药物，每天1次，连续8周。给药1 h后，除空白组给蒸馏水外，其余各组均用 56° 的二锅头白酒灌胃，第1周8 mL·kg-1， 以后每周增加 1 mL，直至15 mL·kg-1，连续灌胃8周。

1.3 观察指标

1.3.1 血清中相关生化指标测定 末次给酒和药物后禁食不禁水12 h，脱臼处死，腹主动脉取血，分离血清， 根据试剂盒说明书测定ALT、AST、MDA和SOD。

1.3.2 肝脏指数的测定 摘取肝脏，用电子天平秤肝湿重，计算肝脏指数[肝脏指数(%)=肝脏质量(g)/体重(g)×100%]。

1.3.3 IL-6、TNF-α、IFN-γ和TGF-β1含量检测 采用 ELISA法检测大鼠血清 TNF-α，IL-6、IFN-γ和TGF-β1含量。严格按试剂盒说明书步骤操作。

1.3.4 组织病理学检查 每只鼠都摘取肝右叶，用4% 的甲醛固定，制备石蜡切片，HE 染色，进行病理组织学检查。

2 结果

2.1 TASA对大鼠肝脏指数的影响 与空白组相比，模型组大鼠肝脏指数显著增加(P<0.05)；与模型组相比，TASA各组大鼠肝脏指数显著减小(P<0.05或P<0.01)。结果见表1。

表1 TASA对慢性酒精性肝损伤大鼠肝脏指数的影响

2.2 TASA对慢性酒精性肝损伤大鼠肝功指标的影响 与空白组相比，模型组大鼠ALT和AST显著升高(P<0.01)；与模型组相比，TASA大、中剂量组ALT和AST显著降低(P<0.05或P<0.01)。见表2。

表2 TASA对慢性酒精性肝损伤大鼠肝功指标的影响

2.3 TASA对慢性酒精性肝损伤大鼠血清MDA含量和SOD活性的影响 与空白组相比，模型组大鼠MDA含量显著升高(P<0.01)，SOD活性显著降低(P<0.01)；与模型组相比，TASA大、中剂量组MDA含量显著降低(P<0.01)，SOD活性显著升高(P<0.01)。见表3。

表3 TASA对慢性酒精性肝损伤大鼠MDA含量和SOD活性的影响

2.4 TASA对慢性酒精性肝损伤大鼠细胞因子的影响 与空白组相比，模型组IL-6、TNF-α、IFN-γ和TGF-β显著升高(P<0.01)；与模型组相比，TASA给药组可以显著的降低IL-6、IFN-γ和TGF-β1的含量(P<0.05或P<0.01)，TNF-α有降低的趋势。见表4。

表4 TASA对慢性酒精性肝损伤大鼠细胞因子的影响

2.5 TASA对慢性酒精性肝损伤大鼠肝组织病理学形态的影响 正常组大鼠肝组织结构正常，肝细胞排列整齐、有序，无细胞肿胀、脂肪变性、炎症细胞浸润等现象。酒精模型组肝细胞排列疏松，各结构层次模糊不清，炎症细胞浸润，细胞中着色深浅不一。与酒精模型组相比，联苯双酯组，TASA高、中、低剂量组肝组织病理学形态有较大改善，肝细胞排列较为整齐，炎症细胞浸润等现象减轻。

3 讨论

临床上判断肝功能是否受损及受损的程度通常以ALT及AST水平的变化作为主要指标，而酒精性肝损伤患者的肝功能水平也会发生变化，ALT及AST水平会升高[10]。本研究结果显示，模型组大鼠ALT和AST显著升高，肝脏指数显著增加，给予TASA组大鼠ALT、AST和肝脏指数显著降低，说明TASA对慢性酒精性肝损伤具有保护作用。从病理学组织切片能看出模型组肝细胞排列疏松，各结构层次模糊不清，炎症细胞浸润，细胞中着色深浅不一。与模型组相比，TASA各剂量组肝组织病理学形态有较大改善，肝细胞排列较为整齐，炎症细胞浸润等现象减轻。这也说明TASA对慢性酒精性肝损伤具有保护作用。

关于酒精性肝损伤的发病机理比较多，其中氧化应激是导致酒精性肝损伤非常重要的发病机制之一，体内的氧化应激反应可以通过酒精来激活，从而使肝组织遭到破坏[11]。氧化应激导致的肝损伤最终会产生大量的脂质过氧化产物——MDA，所以可以用MDA反映组织过氧化损伤的程度，同时MDA还可以造成细胞代谢和功能障碍；酒精和它的代谢产物乙醛都可以引起肝细胞膜脂质过氧化，进而产生MDA[12]。SOD是体内的抗氧化酶，可以清除细胞内自由基，降低 MDA 的产生，保护细胞免受氧化损伤，其活力可间接反映机体清除氧自由基的能力，SOD水平的高低是衡量机体抗氧化能力大小非常重要的一个指标[13]。由本实验研究结果可知，TASA可以显著降低慢性酒精性性肝损伤大鼠血清中MDA含量，显著升高SOD活性，说明TASA可以降低慢性酒精性肝损伤的氧化应激作用，降低酒精对肝细胞的损伤，这可能是TASA发挥肝脏保护作用的原因之一。

TNF-α具有双重作用，在正常生理情况下，机体释放适量 TNF-α参与自动防御，改善机体平衡状态，起积极保护作用；但是在诸如肝功能异常、炎症反应和败血症等条件下，机体释放大量 TNF-α，对机体产生细胞毒性作用[14]。TNF-α作为一种促进炎症进展的因子，通常由肝脏活化的单核巨噬细胞产生，也是多种促炎因子及炎症介质异常释放的关键因子，其主要清除部位位于肝脏[15]。有研究[16]表明，肝脏疾病患者血清TNF-α水平与肝损伤的生化指标具有正相关关系。本实验结果也显示肝损伤模型组TNF-α水平显著升高。TNF-α除了可直接作用肝细胞而产生毒性，造成肝损伤、坏死，还可诱生IFN-γ及IL-6等炎症因子[17]。这些因子又增强了TNF-α的作用,高水平的IL-6与TNF-α协同作用, 加重肝损伤[18]。所以血清中TNF-α和IL-6含量变化可敏感地反映出肝组织损伤的程度[19]。IFN-γ被认为是一把双刃剑，因为它对病毒防御至关重要，但也可能导致肝脏损伤[20]。IFN-γ作为一种炎性细胞因子，可引起肝细胞的细胞周期阻滞和细胞凋亡[21]。本研究结果显示，模型组大鼠 TNF-α、IL-6和 IFN-γ较正常组大鼠显著升高，表明TNF-α 、IL-6和 IFN-γ参与了慢性酒精性肝损伤过程，通过TASA干预后，IL-6和 IFN-γ均显著降低，TNF-α水平有降低趋势，提示TASA能减轻慢性酒精型性肝损伤的炎症反应，这也可能是TASA发挥对肝损伤保护作用机制之一。

TGFβ1 在复杂的纤维化过程扮演着非常重要的角色[22]。TGFβ1是一种多效性的细胞因子参与免疫反应和肝纤维化的发展，导致肝星状细胞的激活和增生，进一步激活肝星状细胞分泌TGFβ1，增加胶原蛋白产生和促进肝纤维化进展，进而加重肝损伤[23]。由本实验结果可知，模型组大鼠TGFβ1显著升高，经过TASA干预后，TGFβ1显著下降，提示TASA可能通过降低TGFβ1水平，促进肝细胞再生，阻止纤维化进程，达到修复肝损伤的目的。

综上所述，TASA对酒精引起的慢性肝损伤具有很好的保护作用，这种保护作用的发挥可能与TASA抗氧化应激和抗炎作用以及促进肝细胞再生作用、阻止纤维化进程有关。