UPLC-MS/MS 检测猪肉中硝基呋喃类药物残留方法的优化

史兰琴，孟 凤，任慧慧

山西省太原市动物防疫检疫中心，太原 030027

硝基呋喃类药物是一类人工合成抗菌药，其产生是在呋喃环的5 号位上引入硝基，再在呋喃环的2 号位引入其他基团所组成的一类药物，有着这一结构的药物统称为硝基呋喃类药物。常用的四大硝基呋喃类药物为呋喃它酮（FTD）、呋喃唑酮（FZD）、呋喃西林（NFZ）和呋喃妥因（NFT）。低浓度硝基呋喃类药物对大多数真菌、部分革兰氏菌和原虫都有着很好的抑菌作用，高浓度有灭杀作用[1-3]。研究发现，硝基呋喃类药物存在着强烈的生物毒性，其本体和代谢产物对人类均具有致癌、致畸、致突变的副作用[4]。但由于该药物的成本低及抗菌效果好，使用起来相比其他抗菌药性价比更高，我国在禁止该药物后仍然还有人或组织在销售或使用此类药物。

目前，检测硝基呋喃类药物残留的技术较多，如超高效液相色谱（UPLC）、超高效液相色谱质谱联用法、酶联免疫分析法（ELISA）、免疫层析技术（ICA）和荧光免疫分析法（FIA）等。其中，主要使用的方法是超高效液相色谱串联质谱法，已用于测定不同样品基质中硝基呋喃类药物。本文建立了猪肉中常见4 种硝基呋喃类药物残留的分析方法，优化了提取条件和检测方法，回收率、定量限等参数能够满足现行标准法规的要求，可快速、灵敏、准确地检测猪肉中硝基呋喃类药物残留。

1 材料与方法

1.1 材 料

1）试剂。甲醇、醋酸铵、甲酸、乙酸乙酯、乙腈和正己烷均购自德国Merck 公司；磷酸二氢钾、三氯乙酸均购自北京曼哈格生物科技有限公司。二甲基亚砜、2-硝基苯甲醛、购自美国SIGMA 公司；硝基呋喃类药物4 种代谢物AMOZ、SEM、AHD、AOZ 标准物质，标准品纯度均不低于99%，购自韩国德山药品工业（株），其对应的内标物质购自德国Dr.Ehrensorfer 公司。

2）仪器与设备。ACQUITYUPLCI-ClassPLUS 超高效液相色谱仪串联XevoTQ-Smicro 三重四极杆质谱仪（美国Waters 公司）；电子天平ML204T/02（梅特勒-托利多仪器）；Milli-QAcademic 超纯水器（苏州赛恩斯仪器）；ortex-2 实验室小型涡旋混匀仪（上海叶拓科技）；B1020 台式PH 分析仪（得利特北京科技有限公司）；AYAN-30L1 氮气发生器（上海秉越电子仪器）；M1324R 微量高速冷冻离心机（瑞沃德生命科技）；VP 手动单通道移液器（艾斯玛特仪器贸易）；HD-SYC 水浴恒温振荡器（湖南昊德仪器设备）。

1.2 试验方法

1）标准溶液的制备。硝基呋喃类药物混合标准贮备液：100 μg/mL，精准称取AMOZ、SEM、AHD、AOZ 各10 mg（精确到0.000 1 g）于4 个100 mL容量瓶中，用甲醇定容至标线，超声溶解，于4 ℃可以保存6 个月。硝基呋喃类药物混合标准溶液：10 μg/mL，精密量取100 μg/mL 的4 种硝基呋喃类药物标准贮备液各10 mL 于100 mL 容量瓶中，用甲醇定容至标线。于4 ℃可以保存6 个月。

混合内标储备液的配制：精准称取4 种内标物各0.10 g，分别用甲醇溶解并定容至1 000 mL 的棕色容量瓶中制成质量浓度为100 μg/mL 的混合储备液。于-18 ℃下密封、避光保存，保质期1 个月，使用时按照需求浓度稀释。2-硝基苯甲醛溶液：精准称取7.56 g 2-硝基苯甲醛溶于二甲基亚砜中，定容到50 mL，制成后的浓度为0.1 mol/L。

硝基呋喃类药物混合标准工作液：分别移取适量10 μg/mL 混合标准贮备液于6 个10 mL 容量瓶中，用甲醇定容至标线，配制成硝基呋喃类药物含量为1、5、10、50、100 ng/mL 的系列标准工作液；根据最终的上机质量浓度（10 ng/mL）添加混合内标工作液。

2）样品前处理。取约200 g 的市场猪肉放入组织捣实机充分粉碎后搅匀，精准称取2.0 g（精确到0.01 g）装入50 mL 聚丙烯离心管，剩下部分装入聚乙烯瓶中于-18 ℃冷冻保存。在离心管中加入10 mL 体积比为1∶1 的甲醇-水溶液，涡旋振荡5 min，然后再放入离心机以5 500 r/min 的转速离心5 min，弃去液体。在离心管中依次加入100 μL混合内标工作液（100 ng/mL）、150 μL 2-硝基苯甲醛溶液（0.1 mol/L）、10 mL 10%三氯乙酸溶液，涡旋振荡5 min，置于37 ℃水浴恒温振荡器中避光衍生化反应16 h。衍生化反应完成后，取出离心管，先用1 mol/L 的磷酸氢二钾溶液调节溶液pH 至7.0～8.0，再加入10 mL 乙酸乙酯，涡旋振荡5 min 后放入离心机10 000 r/min 离心2 min，收集乙酸乙酯层，残留物用10 mL 乙酸乙酯重复上述步骤再提取1 次，合并2 次收集的乙酸乙酯层于氮气发生器45 ℃吹干。吹干后的残渣加入1 mL 醋酸铵溶液（浓度与初始流动相相同）充分溶解，再用1 mL 乙腈饱和的正己烷液液萃取除脂，弃去上层正己烷层，下层液体过0.22 μm 滤膜后待测。

3）试验条件。色谱条件：色谱柱为ACQUITYUPLCCSHC18 色谱柱（2.1 mm×100 mm×1.7 μm）；流动相A 为乙腈，B 为0.1%的甲酸和0.5 mmol/mL醋酸铵混合水溶液；柱温35 ℃；进样体积为10 μL；流速为0.25 mL/min；采用梯度洗脱程序0～2.00 min，5%～50% A；2.01～3.00 min，50%～90% A；3.01～3.20 min，90%～5% A；3.21～4.50 min，5% A。

质谱条件：在本试验中离子源使用电喷雾离子源（ESI），正离子扫描；扫描方式：多反应监测（MRM）；电离电压：5.5 kV；离子源温度：500 ℃；气帘气：30 psi，流速10 L/min；雾化气：35 psi，流速10 L/min；辅助气：55 psi，流速10 L/min；碰撞气：氩气（纯度大于99.9%），流量：270 kp；质谱条件详见表1。

表1 4 种硝基呋喃代谢物及其内标的质谱检测条件

2 结果与分析

2.1 样品前处理条件的优化

1）样品洗涤。研究发现呋喃西林的代谢物氣基脈（SEM）产生的机制复杂，来源多样，所以检出SEM 不一定全部是药物滥用造成的，有可能是试验试剂污染、次氯酸钠消毒的副产物及胶带等方式污染的猪肉。而这些污染一般以游离态的形式存在，故试验时应先用甲醇-水溶液洗涤样品，去除游离态的SEM，使仅能检测到与蛋白质结合的结合态代谢物，本研究使用体积比为1∶1 的甲醇-水溶液效果较好。

2）水解与衍生化。硝基呋喃类在动物身体内的代谢过程快速、半衰期较短，而代谢产物和蛋白质的结合物化学性质也比较稳定，可以通过蛋白有机结合物的形态在动物体内较长时间存在，所以很难直接检测到这类药品的原药化合物。该蛋白结合物在适当的酸性条件下能够释放出代谢物，故试验中一般测定其代谢物浓度来反映硝基呋喃类药物的残留。硝基呋喃类药物的代谢物SEM、AOZ、AHD、AMOZ 为小分子化合物，相对分子质量较小，用质谱仪直接检测其代谢物会因为特征离子少、背景干扰大而不能达到检测需求灵敏度，无法精准定性与定量分析。研究发现，可以用2-硝基苯甲醛与代谢物发生衍生化反应（过程见图1），增加其相对分子质量，再对衍生物进行质谱检测分析。本次衍生化反应将盐酸替换成10%的三氯乙酸，其优点是不仅能提供酸性环境让代谢物与2-硝基苯甲醛发生衍生化反应，还能更有效地除去样品中的蛋白质以减少干扰。硝基呋喃代谢物检测一般要求水解衍生化后将pH 调节至7.0～7.5，查阅资料后发现，pH 在7.5～8.0的回收率和pH 在7.0～7.5 的回收率没有明显差别[5]，故将pH 范围扩大至7.0～8.0 更方便试验操作。

图1 硝基呋喃类药物代谢物的水解和衍生化过程

3）提取次数对回收率的影响。在处理硝基呋喃类代谢物时，使用乙酸乙酯对样品萃取的次数对回收率产生了较大的影响，次数过少会使代谢物提取不充分，过多则费时费力。采取合适的提取次数可以简便试验的操作过程，节约试剂和时间，提升试验结果的准确性，研究发现提取次数为3 次时可得最佳回收率。

2.2 标准曲线与检出限

将处理好的标准工作液上机进行测定，并制作标准曲线，纵坐标为各定量离子的离子质量色谱峰面积与相应内标物的峰面积比，横坐标为对照溶液的浓度。4 种代谢物的回归方程和相关系数如表2所示。根据回归方程和相关系数分析，4 种硝基呋喃类代谢物在1～100 ng/mL 范围内线性关系良好，4种代谢物的检测下限均为0.3 μg/kg。

表2 4 种硝基呋喃代谢物的回归方程及相关系数

2.3 回收率和精密度

1.0、2.0、5.0 μg/kg 添加硝基呋喃代谢物混合标准工作液，再按照最终质量浓度10 ng/mL 添加混合内标标准液，得到的平均回收率和RSD（n=6）如表3 所示。说明使用上述试验方法检测硝基呋喃类药物残留方法具备良好的可行性。

表3 4 种硝基呋喃代谢物的回收率与精密度

3 结 论

本研究使用的超高效液相色谱串联质谱法，除去蛋白质的脂肪效果较好，减少了测定过程中的杂物干扰，在代谢物质量浓度为1～100 ng/mL 时有良好的线性关系，检测下限均为0.3 μg/mL，平均回收率为91.0%～117.8%，RSD 为2.9%～7.3%，均满足国家标准要求。本方法还具有操作简便、成本小、回收率高、结果稳定可靠等优点，适用于市场猪肉中硝基呋喃类药物残留的检测。