青稞硝酸盐转运蛋白基因HvnNPF4.5 的克隆和亚细胞定位

刘凡语，安立昆，姚晓华，姚有华，崔永梅，白羿雄，李 新，吴昆仑

（青海大学农林科学院，青藏高原种质资源研究与利用实验室，青海省青稞遗传育种重点实验室，国家麦类改良中心青海青稞分中心，青海 西宁 810016）

青稞（Hordeum vulgareL. var.nudumHook. f.）是青藏高原地区最具特色的作物，是当地居民赖以生存的粮食和饲料、食品加工原料，在青藏高原农业历史文化和农业经济发展中有着重要的地位[1-4]。青藏高原地区气候恶劣，青稞在青藏高原有着悠久的栽培历史，虽然青稞已经适应了青藏高原的恶劣条件，但是各种逆境胁迫，尤其是贫瘠的土壤依然严重制约着青稞的种植和生产[5-8]。氮元素是影响作物生长发育和产量品质的重要大量元素之一。在作物的种植过程中为了提高产量，会施用大量的氮肥。然而，氮肥施用过量和氮肥流失一直是困扰我国农业生产的重大问题[9]。长期过量施用氮肥会造成土壤结构破坏，流失的氮肥还会污染农田周边环境，不利于生态农业可持续发展[10]。因此，减少农业生产中氮肥的施用量、提高作物对氮肥的利用效率对于农业可持续发展具有重要意义。青稞主要种植地集中在生态极为脆弱敏感的青藏高原地区，长期大量施用氮肥会对青藏高原地区生态环境平衡造成严重破坏[11-13]。因此，在保证青稞产量的同时，尽可能减少青稞生产过程中氮肥的施用，对青藏高原农业生态的可持续发展具有重要意义。

植物硝酸盐转运蛋白家族NPFs 是广泛存在于各种植物中的一类低亲和硝酸盐转运蛋白家族，其主要功能是在植物体受到低氮胁迫时对硝酸盐进行吸收和转运，此外还参与植物次生代谢产物以及激素等物质的转运[14-15]。很多研究表明，NPFs 家族中一些成员参与菌根调控的硝酸盐吸收和同化过程。杨晓锋[16]研究水稻硝酸盐转运蛋白基因OsNPF4.5时发现，OsNPF4.5位于水稻第1 条染色体上，具有7 个外显子和6 个内含子，可编码609 个氨基酸，亚细胞定位结果显示其蛋白位于细胞膜上，该基因的表达受丛枝菌根强烈诱导，而同一家族的其他基因表达并不受丛枝菌根的影响，此外该基因的表达受外源硝酸盐的诱导，外源的脱落酸和水杨酸会抑制其表达。Wang 等[17]发现水稻OsNPF4.5 蛋白定位于细胞膜上，与玉米ZmNPF4.5 和高粱SbNPF4.5 亲缘关系最近，是一种参与水稻菌根吸收和同化硝酸盐的低亲和硝酸盐转运蛋白；将OsNPF4.5转入水稻中，转基因植株的氮素吸收效率明显高于野生型植株，且生长速度加快，其菌根途径贡献的氮大约有45%通过OsNPF4.5 转运，表明OsNPF4.5 在禾本科植物通过菌根途径吸收利用硝酸盐的过程中起主导作用。黄圣宇[18]对枳硝酸盐转运蛋白基因PtrNPF5.2进行了研究，发现PtrNPF5.2具有12 个跨膜结构，在第6～7 跨膜域间存在一个大亲水环，其蛋白定位于细胞膜上，符合硝酸盐转运蛋白家族的典型特征，PtrNPF5.2主要在与丛枝菌共生的细胞中表达，表明该基因可能参与菌根调控的硝酸盐吸收和同化过程。冯慧敏等[19]的研究表明，水稻OsNPF7.9基因表达的蛋白定位于细胞膜上，有12 个跨膜结构，在叶片、花和根中都有表达，但其表达不受硝态氮或铵态氮及其浓度差异的影响，将其转入水稻中发现转基因植株由根系向地上部的硝酸盐转运能力增强，表明OsNPF7.9 在植物将硝酸盐从根系向地上部转运的过程中发挥着重要的作用。夏秀东[20]的研究表明，水稻硝酸盐转运蛋白基因OsNPF2.4由2个内含子和3 个外显子组成，其蛋白由583 个氨基酸组成，有12 个跨膜结构，定位于质膜上，在叶鞘、叶片、花粉和刚萌发的幼芽中均有表达，主要在根的表皮细胞、木质部薄壁细胞等中表达，另外，该基因敲除突变体对NO3-的吸收量明显低于野生型，说明OsNPF2.4的敲除会影响水稻体内的运输，而其过表达会显著增加水稻对的吸收。

目前，关于植物硝酸盐转运蛋白基因NPFs家族的研究在青稞中尚未见报道。该研究从 “昆仑14”青稞中克隆得到青稞硝酸盐转运蛋白基因HvnNPF4.5，对其基因和蛋白结构进行了生物信息学分析，并对其亚细胞定位进行了研究，以期为青稞硝酸盐转运蛋白进一步研究利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试青稞品种“昆仑14”以及对照品种本氏烟草（Nicotiana benthamiana）均由青藏高原种质资源研究与利用实验室保存。TransZol Up Plus RNA 提取试剂盒和PCR 产物连接及cDNA 合成试剂盒EasyScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix（AE301-03）购自北京全式金生物技术有限公司。高保真PCR酶PrimeSTAR 和Mighty TA-cloning Reagent Set for PrimeSTAR 克隆试剂盒购自Takara 宝生物工程（大连）有限公司。Gateway 克隆试剂盒购自Invitrogen 公司。大肠杆菌感受态菌株为自制DH5α 感受态。引物合成和测序由上海生工生物工程有限公司完成。

1.2 试验方法

1.2.1 青稞DNA 和RNA 提取采用CTAB 法从青稞叶片中提取DNA，采用TransZol Up Plus RNA 提取试剂盒从青稞叶片中提取RNA，并参照cDNA 合成试剂盒合成cDNA，所有样品于-20℃冰箱保存。

1.2.2 青稞HvnNPF4.5 基因克隆和启动子区域序列克隆将已报道的水稻OsNPF4.5基因序列输入NCBI （https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中 搜 索 得 到大麦HvNPF4.5，根据其基因和起始密码子ATG 前2 000 bp 序列设计引物。基因克隆正向引物F：5'-ATG TACTTCATGTTGGTGATG-3'，反向引物R：5'-CTACAT GACAGACTTGCTG-3'。启动子区域序列克隆正向引物F：5'-CGTGCGTGCTAACGTTCT-3'，反向引物F：5'-GA TAAGGTTCACGGCTAGA-3'。以青稞基因组cDNA 和DNA 为模板分别克隆青稞HvnNPF4.5序列和启动子区域序列。PCR 程序为：94℃ 2 min；98℃ 10 s，58℃30 s，68℃ 1 min（扩增启动子区域序列为2 min），35个循环；4℃保存。将PCR 产物与TA 克隆载体连接并转化大肠杆菌DH5α，筛选阳性克隆进行测序。

1.2.3 青稞HvnNPF4.5 生物信息学分析使用GSDS 2.0（http://gsds.gao-lab.org/）对基因结构进行预测。使用Plant CARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/web tools/plantcare/html/）对启动子区域元件进行预测分析。使 用Protparam（https://web.expasy.org/protparam/） 对蛋白质的物理和化学性质进行预测。使用kinasephos2（http://kinasephos.mbc.nctu.edu.tw/index.php）对蛋白磷酸化位点进行预测。使用SignalP 5.0 服务器（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）对蛋白信号肽进行预测分析。使用TMHMM-2.0 （http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）对跨膜结构进行预测。使用SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）对蛋白预测二级结构进行分析。使用SWISS-MODEL（https://swissmodel.expasy.org/）进行同源建模，生成三级结构再建模。

在NCBI 中搜索得到拟南芥（Arabidopsis thaliana）、甘蓝型油菜（Brassica napusL.）、节节麦（Aegilops tauschii subsp.tauschii）、水稻（Oryza sativaL.）、二穗短柄草（Brachypodium distachyon）、玉米（Zea maysL.）、羊黍（Panicum hallii）、黍稷（Panicum miliaceum）、柳枝稷（Panicum virgatum）、二型花（Dichanthelium oligosanthes）、小米（Setaria italica）、狗尾草（Setaria viridis）、南荻（Miscanthus lutarioriparius）、高粱（Sorghum bicolor）、大麦（Hordeum vulgareL.）、康藏嵩草（Carex littledalei）、芦笋（Asparagus officinalis）、山药（Dioscorea cayenensissubsp.rotundata）、油棕（Elaeis guineensis）、海枣（Phoenix dactylifera）、野芭蕉（Musa acuminatasubsp.malaccensis）、无 油 樟（Amborella trichopoda）、沉水樟（Cinnamomum micranthum）、毛果杨（Populus trichocarpa）、蓖麻（Ricinus communis）、甘蓝型油菜（Brassica napus）、萝卜（Raphanus sativus）、白菜型油菜（Brassica rapa）、盐芥（Eutrema salsugineum）、亚 麻 芥（Camelina sativa）、荠 菜（Capsella rubella）的NPF4.5 蛋白。将拟南芥AtNPF4.5、甘蓝型油菜BnNPF4.5、节节麦AtsNPF4.5、水稻OsNPF4.5、二穗短柄草BdNPF4.5、玉米ZmNPF4.5 的蛋白序列，采用DNAMAN7.0 与大麦HvNPF4.5 和青稞HvnNPF4.5蛋白序列进行比对，并根据NCBI 提供的蛋白信息分析各蛋白的保守结构域。将所有物种的NPF4.5 蛋白序列输入MEGA7 中以最大似然法构建系统进化树。

1.2.4 青稞HvnNPF4.5 亚细胞定位研究采用载体pSATN1-mkate 利用gatway 方法构建亚细胞定位载体。设计带有attB 位点的引物，正向引物F：5'-GGGGAC AAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTATGTACTTCATG TTGGTGATG-3'，反向引物R：5'-GGGGACCACTTTG TACAAGAAAGCTGGGTCATGACAGACTTGCTG-3'。对已克隆的HvnNPF4.5CDS 序列进行克隆，按照gatway 反应试剂盒说明书完成载体构建，并对载体进行测序验证。将构建好的载体通过冻融法转化入农杆菌EHA105 中。制备好农杆菌重悬液后将菌液注射入烟草叶片下表皮，置于全黑暗环境22℃培养3 d 后将叶片切成1.5 cm2大小，置于Nikon C2-ER 激光共聚焦显微镜下观察并拍照。

2 结果与分析

2.1 HvnNPF4.5 生物信息学分析

2.1.1 HvnNPF4.5 的基因结构和启动子功能元件预测分析测序结果表明，青稞和大麦的HvnNPF4.5基因和启动子序列一致，HvnNPF4.5所对应的转录本包含2 个内含子和3 个外显子（图1）。HvnNPF4.5基因启动子区域发现48 个TATA-box 和23 个CAAT-box，以及一些与干旱和脱落酸、赤霉素、生长素等植物激素相关的响应元件，其中，关于干旱、脱落酸、赤霉素和生长素的顺式作用元件各1 个（表1）。

图1 青稞HvnNPF4.5 基因结构图

表1 青稞HvnNPF4.5 基因启动子元件分析

2.1.2 HvnNPF4.5 蛋白的理化性质和结构分析由表2 可知，HvnNPF4.5 由600 个氨基酸组成，是疏水稳定蛋白，有12 个跨膜结构（图2）；HvnNPF4.5 蛋白序列中有5 个丝氨酸（Ser）、3 个苏氨酸（Thr）、2 个酪氨酸（Tyr），共8 个磷酸化位点（图3）；无信号肽（图4）；HvnNPF4.5 蛋白二级结构中α 螺旋、延长链、β 转角、无规则卷曲分别占48.83%、11.83%、3.5%、35.83%（图5）；对青稞HvnNPF4.5 蛋白进行同源建模生成三级结构模型，其结构和二级结构预测结果基本一致（图6）。

表2 青稞HvnNPF4.5 蛋白质理化性质分析

图2 青稞HvnNPF4.5 蛋白跨膜结构预测分析

图3 青稞HvnNPF4.5 蛋白磷酸化位点预测

图4 青稞HvnNPF4.5 蛋白信号肽预测

图5 青稞HvnNPF4.5 蛋白二级结构

图6 青稞HvnNPF4.5 蛋白三级结构预测分析图

2.1.3 NPF4.5 蛋白氨基酸序列对比和同源进化分析对青稞HvnNPF4.5 蛋白进行序列比对发现，该蛋白均具有MFS（Major Facilitator Superfamily） 结构域，青稞HvnNPF4.5 与大麦HvNPF4.5 的蛋白序列完全一致（图7）。将青稞HvnNPF4.5 和其他28 种植物的同源蛋白序列构建系统进化树，发现青稞HvnNPF4.5 与大麦HvNPF4.5、节节麦AtsNPF4.5 的亲缘关系最近（图8）。

图7 青稞HvnNPF4.5 蛋白氨基酸序列对比分析

图8 青稞HvnNPF4.5 蛋白与其他植物同源蛋白系统进化树

2.2 青稞HvnNPF4.5 蛋白亚细胞定位结果

将注射了农杆菌的烟草叶片在显微镜下观察，发现在细胞膜上检测到红色荧光信号，说明HvnNPF4.5蛋白定位在细胞膜上（图9）。

图9 青稞 HvnNPF4.5 蛋白亚细胞定位

3 结 论

植物硝酸盐转运蛋白分为高亲和力和低亲和力2 种类型，高亲和力硝酸盐转运蛋白主要是在正常条件下维持植物体对硝酸盐的吸收和转运，低亲和力硝酸盐转运蛋白主要是在植物体受到低氮胁迫时发挥作用，为植物提供更充足的氮元素[21-23]。硝酸盐转运蛋白基因家族NPFs属于低亲和力硝酸盐转运蛋白，是植物吸收、转运和同化硝酸盐的主要基因家族，在植物氮元素吸收利用中发挥着重要作用[16,24-25]。

除了水稻等模式植物外，其他植物的硝酸盐转运蛋白基因家族NPFs研究报道也较多。袁婷婷等[26]的研究发现，毛竹中有27 个NPFs家族基因成员，分为7 个亚家族，PeNPFs启动子序列中包含多种与低温和干旱等非生物胁迫以及GA3和NAA 等激素响应相关的元件，PeNPFs主要定位于细胞膜和液泡中，在叶片、花序、根、鞭和笋中均有表达，并且受多种非生物胁迫和植物激素的诱导表达，PeNPFs的不同成员在不同组织以及应对不同环境过程中发挥着多样化的功能。王倩[27]的研究发现，73 个苹果MdNPFs成员可分为8 个亚族，且分布在17 条染色体上，有12 个跨膜结构域，在根、茎、叶、花和果实中均有表达，其表达受硝酸盐浓度的影响，将其中的MdNPF6.5基因转入苹果愈伤组织中发现转基因愈伤组织在低氮下鲜重明显高于对照，表明MdNPF6.5在提高苹果耐低氮能力方面具有重要作用。计丽[24]的研究发现，大多数木薯MeNPFs基因含有2～5 个内含子，少数只含有1 个内含子，72 个MeNPFs基因不均匀分布于18 条染色体上；进一步研究发现MeNPF6.2和MeNPF6.3有12 个跨膜结构，均定位于细胞膜上，MeNPF6.2和MeNPF6.3分别在木薯叶片和幼苗根中受硝酸盐诱导表达；将MeNPF6.2基因转入木薯和水稻中发现，转基因木薯植株叶面积更大、茎杆更加粗壮、侧根数量也明显增多，转基因水稻则表现为百粒重和粒宽显著增加，表明MeNPF6.2基因在木薯响应低氮胁迫时起重要作用，在作物耐低氮改良过程中应用前景广阔。马嘉俊等[14]对白菜BrNPFs进行研究时发现，白菜BrNPFs基因家族成员分为8 个亚族，不均匀地分布在10 条染色体上，共有72 个成员，亚细胞定位预测结果显示BrNPFs 均定位在质膜上。笔者的研究结果与以上研究报道基本相符。HvnNPF4.5包含2 个内含子，启动子区有与干旱以及脱落酸、赤霉素、生长素相关的顺式活性作用元件；HvnNPF4.5 蛋白的分子量为66 875.31 Da，理论等电点为8.85，具有8 个磷酸化位点，无信号肽结构，也具有12 个跨膜结构，在第6～7 跨膜域间同样存在一个大亲水环；HvnNPF4.5和其他物种的同源蛋白都有MFS 结构域，青稞HvnNPF4.5 与大麦HvNPF4.5、节节麦AtsNPF4.5 的亲缘关系最近；亚细胞定位结果显示青稞HvnNPF4.5定位于细胞膜上。

青稞是青藏高原地区最具特色的作物，减少青稞生产中氮肥的施用量，提高青稞对氮肥的利用效率对于青稞种植业可持续发展具有重要意义。该研究克隆得到了青稞硝酸盐转运蛋白基因HvnNPF4.5，对其基因和蛋白进行了生物信息学分析，并对其进行亚细胞定位研究，其结果为青稞氮元素吸收、转运和同化相关基因研究提供了一定的参考。