纤维素降解菌的筛选及对玉米秸秆降解的影响

张鹏飞，孟会生，井国雁，陈泽坤，马晓楠

(山西农业大学资源环境学院，山西太谷 030801)

我国秸秆资源种类丰富、分布广泛。据统计，我国每年可以产生10.4亿t的秸秆，占世界秸秆总产量的20%～30%[1]。目前我国处理秸秆多采用秸秆还田的方式。秸秆还田虽然能释放有机物质改善土壤结构[2]，但秸秆中有大量的纤维素、半纤维素等，在自然状态下降解比较长，在此期间有可能会影响种子的正常生长。如何合理利用秸秆，缓解农村能源物资缺乏严重的现象已经成为我国一个难题[3]。自2000年，我国就颁布了关于秸秆一系列如何利用和解决秸秆禁烧的政策[4]。但秸秆焚烧的现象还是随处可见，因此如何合理使用秸秆并且提高秸秆的利用率仍然是社会关注的焦点。

相比较使用化学方式处理秸秆的方法，低成本、无污染的微生物降解方法更具有研究价值。微生物降解法是快速降解纤维素的一种快速有效的方法，主要利用土壤中原有的微生物，增加微生物酶的活性对秸秆进行降解。研究表明，正确合理使用微生物降解菌剂可以降低水稻秸秆的强度，明显促进土壤中的养分、微生物多样性等，从而使作物在一定程度上增产增收[5]，对农业可持续发展具有重要作用。

在自然环境中，纤维素降解菌的种类丰富且数量庞大，主要包括纤维黏菌和纤维杆菌等细菌，纤维放线菌、诺卡氏菌属和霉菌属等放线菌，木霉属、曲霉属、青霉素等真菌[6]。生存环境也各式各样，如动物肠胃、土壤、森林等。研究表明，纤维素降解菌可增强土壤降解秸秆能力，对农业废弃物有重要的作用。如纤维素转化商用酶作用于玉米秸秆等不同种类的木质素原料[7]；从臧牛胃中分离出来2株纤维素降解菌作用于青贮饲料，结果发现纤维素菌落可改善饲料品质。虽然菌类资源丰富，但目前发现的可实际应用于农田并降解秸秆的较少。该研究主要是通过试验筛选与构建高效纤维素微生物菌群，加快玉米秸秆还田速度，对合理利用秸秆资源、减少环境污染具有现实意义。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1样品采集。土壤样品采自山西省晋中市太谷区山西农业大学资源环境学院试验田(含枯枝落叶、腐败秸秆、动物粪便等的土壤)。

1.1.2培养基。菌株的筛选和分离采用羧甲基纤维素培养基和赫奇逊液体培养基[8]；保存菌株采用液体LB培养基[9]；初筛菌株纤维素能力采用滤纸条培养基[10]。

1.2 方法

1.2.1菌株的分离、筛选。称取采集的样品土10.00 g,并在无菌条件下放于装有90.00 mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀并静置，稀释成10-5、10-62个浓度菌液。用移液枪取0.1 mL 10-5稀释液涂布于好氧性纤维素分解培养基平板上，同样的方法取10-6稀释液并涂布。每个稀释度涂布3个平板，30 ℃培养箱培养5 d左右。每个菌落挑选单个菌株置于好氧性纤维素分解培养基,每皿2个，然后1 mol/L刚果红染色15 min，然后用1 mol/L NaCl浸洗，在12、24、36 h测定每个菌落直径(d)和其产生水解圈直径(D)，并计算水解圈直径(D)和菌落直径(d)的比值(D/d)。水解圈与菌落直径比值可以简单判断该菌株的纤维素降解能力。

1.2.2菌株的鉴定。对筛选出的菌株进行生理生化鉴定[11]，同时利用16S rDNA测得基因通用引物(S10:5′-AAGTCGAACGATGAACCA-3′、S20:5′-GCAGTCGAACGATGAAGC-3′、S30：5′-AAGTCGAACGATGAAGCC-3′)扩增菌株的16S rDNA基因片段。运用NCBI Blast分析工具对测序结果进行比对，从而鉴定菌株。

1.2.3玉米秸秆降解试验。将粉末状500 g的玉米秸秆放在花盆里，置于30 ℃的环境中，试验设7个处理，分别为CK(不加菌剂，加等量清水)、S10、S20、S30、S10S20、S10S30、S10S20S30，每盆加入10 mL菌剂，每隔2 d观察玉米秸秆干物质降解率，培养20 d后，测定总碳、纤维素、半纤维素含量。干物质降解率=(发酵前的干物质量-发酵后的干物质量)/发酵前干物质量×100%。

1.2.4测定方法。采用水解圈和菌落直径比值、滤纸条的降解效果2种方法进行初筛菌株。菌株纤维素酶、内切葡聚糖酶、滤纸酶(FPA)活力参照刘东阳等[12]的方法进行测定。

纤维素采用范氏法-重量法[13]进行测定；半纤维素采用2 mol/L盐酸水解法和DNS法相结合[14]进行测定；总有机碳采用TOC分析仪法[15]进行测定。

1.3 数据统计与分析采用Excel 2019对原始数据进行整理，采用SAS对试验结果进行方差分析，并用 Duncan′s 新复极差法进行差异显著性检验(P<0.05)。

2 结果与分析

2.1 纤维素降解菌的分离与筛选纤维素降解菌分解纤维素能力以水解圈与菌落直径的比值来判定。从分离的10株菌株初步筛选3株纤维素降解能力较强的S10、S20、S30。由表1可知，S10、S20、S30这3个菌株水解圈与菌落直径的比值(D/d)随着时间的增加而增加。菌株S10和S20的水解圈和菌落直径的比值较大，培养36 h比值分别为6.12和6.02，而S30的比值为4.52，远远小于S10和S20。

表1 纤维素降解菌的水解圈直径(D)、菌落直径(d)及其比值

2.2 不同菌株的滤纸降解效果与纤维素酶活性以定性滤纸为底物初步研究纤维素降解菌的分解能力，结果如表2所示。纤维素分解菌S10菌株和S20菌株具有较强的滤纸分解性能，静置3 d后可以清晰地观察到滤纸有明显的降解，5 d 后培养基开始变黄，到第7天滤纸条明显开始崩解。S30菌株在第3天没有明显的变化，到第5天开始滤纸条降解，到第7天培养基才开始变黄。由此可见，S10、S20菌株纤维素降解能力强于S30菌株。

对S10、S20、S30纤维素降解菌进行复筛，将3株纤维素降解菌发酵培养72 h后，测其纤维素酶的活性，结果发现，3株纤维素降解菌中S10的纤维素酶活性最大，为65.38 U/mL，其次为S20菌株，纤维素酶活性为59.29 U/mL，S30菌株纤维素酶活性最小，为45.74 U/mL。S10菌株比S20、S30菌株纤维素酶活性分别高6.09、19.64 U/mL。综上所述，S10单菌株纤维素酶活性远远强于S20和S30，因此可选择S10单菌株进行后期试验。

2.3 分子生物学鉴定对S10、S20、S30菌株进行16S rDNA鉴定，结果显示(图1)，S10、S30与栗褐链霉菌多个菌株具有高度的同源性，S20与枯草芽孢杆菌多个菌株具有高度的同源性。因此鉴定S10、S30为栗褐链霉菌，S20为枯草芽孢杆菌。

图1 基于16S rDNA纤维素分解菌S10(A)、S20(B)、S30(C)的系统发育树

2.4 不同菌株组合对玉米秸秆降解效果的影响从不同菌株及其组合对玉米秸秆干物质降解的影响(图2)可以看出，不同单菌株和1∶1混合双菌株以及1∶1∶1混合三菌株作用玉米秸秆，与对照相比，均有明显的降解效果，玉米秸秆的干物质降解率随时间的延长而增长。在前期，各处理玉米秸秆干物质降解率增长较快，在4～6 d时，不同菌株及其混合菌株组合对玉米秸秆干物质降解率均较快，S10、S20、S30、S10S20、S10S30、S20S30、S10S20S30分别增长49.89%、48.42%、47.47%、51.06%、57.00%、55.11%、53.69%，混合菌株处理玉米秸秆干物质降解率均高于单菌株的，增长最快的是1∶1混合双菌株S10S30；在后期，各处理玉米秸秆干物质降解增长趋势开始减缓，在6～8 d时，不同处理间的降解增长趋势均较慢，S10、S20、S30、S10S20、S10S30、S20S30、S10S20S30分别增长1.44%、1.26%、3.66%、9.59%、5.43%、6.82%、9.17%，增长最缓慢的是单菌株S20；在8～10 d，玉米干物质降解率虽有增长，但增长趋势不明显。如图2所示，混合三菌株S10S20S30对玉米秸秆干物质降解率均为最高，可用于后期试验。

图2 不同菌株组合对玉米秸秆干物质降解率的影响

2.6 不同菌株组合对玉米秸秆的纤维素、半纤维素和总有机碳含量的影响测定玉米秸秆中纤维素、半纤维素、有机碳含量可以清晰反映菌株对玉米秸秆的降解作用，进而挑选优质菌株应用农田生态系统，解决秸秆堆肥的问题。从不同菌株对玉米秸秆中纤维素、半纤维素、总有机碳含量的影响(表3)可以看出，S10、S20、S30不同单菌株和1∶1混合双菌株以及1∶1∶1混合三菌株S10S20S30处理后，与对照相比均差异显著，玉米秸秆的纤维素、半纤维素、总有机碳的含量均有明显的下降趋势；S10、S20、S30、S10S20、S10S30、S20S30、S10S20S30处理玉米秸秆，其纤维素含量与对照相比分别下降了14.74%、11.54%、7.80%、26.79%、23.27%、19.83%、27.21%，半纤维素含量分别下降了14.46%、9.42%、7.82%、19.36%、17.80%、14.23%、20.02%，总有机碳含量与对照相比分别下降了4.65%、3.50%、1.85%、7.59%、8.68%、9.68%、11.55%。综上所述，混合三菌株S10S20S30对玉米秸秆的纤维素、半纤维素、总有机碳含量影响最大，单菌株S30为最弱，可选择S10S20S30用于后期的试验。

表3 不同菌株组合对玉米秸秆的纤维素、半纤维素和总有机碳含量的影响

3 讨论与结论

秸秆还田过程中使用纤维素降解菌剂可提高农作物秸秆的降解速度，可以有效解决秸秆还田和堆肥问题[16]。耿丽平[17]研究发现在农田施加纤维素降解菌培养30 d时使小麦植株生物量增加16.8%，常勇等[18]研究表明水稻中后期秸秆还田不仅增加水稻产量，还改善土壤理化性质。多数研究表明秸秆降解改善土壤理化性质，为植株根系正常生长发育提供良好的环境和所需的营养成分，从而增加作物产量[19-21]。该试验采用赫奇逊培养基分离纤维素降解菌，利用刚果红平板法和滤纸崩析程度来筛选纤维素降解菌，这样不仅可以保证筛选的菌株具有高效的纤维素分解能力，而且还能保证菌株的纯化度；最后筛选出3株纤维素降解能力较强的单一菌株，根据16S rDNA基因序列分析结果，并且结合菌株的形状、大小、颜色等确定S10为栗褐链霉菌、S20为枯草芽孢杆菌、S30为栗褐链霉菌。

秸秆中纤维素结构较为复杂，降解纤维素是多种酶共同作用的效果。该试验通过不同菌株作用玉米秸秆，测其纤维素、半纤维素、总有机碳含量的变化。结果发现，虽然单菌株S10、S20、S30与对照相比有很好地降解玉米秸秆纤维素的效果，但混合菌株比单菌株有更好的作用效果，尤其是1∶1∶1混合三菌株效果最好；这可能是3种菌株有协同作用，增强了降解纤维素的能力。这与宫玉胜等[22]研究发现的混合菌株纤维素能力增强是高度相似的。该试验仅1∶1∶1混合三菌株作用于玉米秸秆，其他配比或者加入其他种菌株和其他降解纤维素物质，其降解纤维素能力增强还是减弱仍然还需要后期试验进行验证；并且该菌株作用于实际田间，是否对土壤的理化性质发生改变仍然需要进一步证明。

综上所述，混合菌株作用玉米秸秆的纤维素降解能力显著高于单菌株；其中混合三菌株S10S20S30的降解纤维素能力最强，可作为高效纤维素降解菌，加快秸秆还田，减少环境污染，在降解玉米秸秆方面也有较大的开发前景。