不同生长阶段白花蛇舌草高效液相色谱指纹图谱及化学模式识别

黄家辉

（中国人民解放军联勤保障部队第九○○医院药剂科，福建 福州 350000）

白花蛇舌草属茜草科植物白花蛇舌草Hedyotis diffusa的干燥全草，为民间常用传统中药材，味苦、甘，性寒，其叶形如舌，花白色，又名蛇舌癀、羊须草，主要分布于我国广西、湖南、云南等地［1-2］。现代药理学研究表明，白花蛇舌草含环烯醚萜类（车叶草苷、去乙酰车叶草酸酐）、黄酮类（槲皮素、芦丁和山柰酚）、三萜类、有机酸类（阿魏酸、4 - 香豆酸）等成分，具有抗氧化及增强非特异性免疫作用，对多种肿瘤细胞有抑制作用［3-4］。主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）法是化学模式识别常用的技术手段，具有直观、可视化的分类效果和高精度的预测性，广泛应用于中药材的质量评价［5］。白花蛇舌草化学成分复杂，毒副作用小，临床应用广泛，但缺乏法定的质量控制方法，仅收载于各省的中药材炮制规范。虽已有文献报道运用高效液相色谱（HPLC）法测定该药材中槲皮素、熊果酸、车叶草苷等多种成分的含量［6-8］，但未报道不同生长阶段白花蛇舌草化学成分的变化。为全面、整体监控白花蛇舌草整个生长阶段的质量，本研究中采用HPLC 法分析白花蛇舌草的生长期、开花期、结果期3 个生长阶段指纹图谱的差异，筛选差异标志物，并通过PCA 及OPLS-DA法分析白花蛇舌草的最佳采收期，为其质量控制提供理论支持。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

e2695 - 2998 型高效液相色谱仪（美国沃特世公司），配有2998型二极管阵列检测器（DAD）；AL105A 型电子天平（梅特勒-托利多仪器<上海>有限公司，精度为0.01 mg）；Elmasonic P 型超声波清洗器（德国Elma公司，功率为350 W，频率为40 kHz）；QYSW-20A型超纯水仪（美国Millipore公司）。

1.2 试药

对照品车叶草苷（批号为181117，含量≥98.0%），去乙酰车叶草酸酐（批号为190121，含量≥96.0%），山柰酚（批号为180928，含量≥98.0%），均购于成都瑞芬思科技有限公司；对照品4 - 香豆酸（批号为112037 -201801，含量以99.3%计），阿魏酸（批号为110773 -202015，含量以99.2%计），槲皮素（批号为100081 -202010，含量以 98.3% 计），芦丁（批号为 100080 -202012，含量以92.5%计），均购自中国食品药品检定研究院；乙腈、甲醇均为色谱纯，其他试剂均为分析纯；12 批白花蛇舌草（编号为S1-S12）来源于安徽亳州皖北中药材种植基地，阴干，经福建中医药大学黄叶方教授鉴定均为正品。采收时间与生长阶段见表1。

表1 12批白花蛇舌草采收时间与生长阶段Tab.1 Harvest time and growth stages of 12 batches of Hedyotis diffusa

2 方法与结果

2.1 色谱条件［9-11］

色谱柱：ShiseidoCapcellPakMGC Ⅱ-C18柱（250mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）- 0.15%醋酸溶液（B），梯度洗脱（0～19 min时6%A，19～35 min时6%A →10%A，35～42 min 时 10%A → 35%A，42～62 min 时35%A → 65%A）；流速：0.9 mL/min；检测波长：238 nm（0～10 min 时去乙酰车叶草酸酐，19～35 min 时车叶草苷），306 nm（10～19 min 时 4 - 香豆酸），323 nm（35～42 min 时阿魏酸），369 nm（42～62 min 时槲皮素、芦丁及山柰酚）；柱温：30 ℃；进样量：10 μL。

2.2 溶液制备

分别取车叶草苷、去乙酰车叶草酸酐、4-香豆酸、阿魏酸、槲皮素、芦丁、山柰酚对照品各适量，精密称定，加甲醇溶解并定容，制成质量浓度分别为225.4，196.8，162.7，200.1，207.9，151.5，181.5 μg/ mL 的混合对照品溶液。取粉碎过2 号筛的白花蛇舌草1.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，称定质量，超声提取（功率为350 W，频率为40 kHz，温度为30 ℃）40 min，放冷至室温，再次称定质量，并用甲醇补足减失的质量，摇匀，经0.45 μm微孔滤膜滤过，即得供试品溶液。

2.3 方法学考察

精密度试验：取白花蛇舌草（编号为S11）适量，依法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件连续进样测定6次。结果以11号峰车叶草苷为参照峰，17个共有峰相对保留时间的RSD为0.17%～0.65%（n=6），相对峰面积的RSD为0.29%～1.02%（n=6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取白花蛇舌草（编号为S11）适量，依法制备供试品溶液，于室温下放置0，5，10，15，20，24，36 h时按2.1项下色谱条件进样测定。结果以11号峰车叶草苷为参照峰，17 个共有峰相对保留时间的RSD为0.28%～0.77%（n=7），相对峰面积的RSD为0.46%～1.83%（n=7），表明供试品溶液在室温下放置36 h内稳定性良好。

重复性试验：取白花蛇舌草（编号为S11）适量，依法制备供试品溶液，平行6 份，按2.1 项下色谱条件进样测定。结果以11号峰车叶草苷为参照峰，17个共有峰相对保留时间的RSD为0.67%～1.23%（n=6），相对峰面积的RSD为0.89%～2.44%（n=6），表明方法重复性良好。

2.4 HPLC 指纹图谱研究

参照峰选定：取12批（编号为S1-S12）白花蛇舌草各适量，依法制备供试品溶液，按2.1 项下色谱条件进样测定。结果色谱图中11 号峰车叶草苷的保留时间适中，峰面积最大且分离度好，故以车叶草苷为参照峰。

相似度评价：采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012 版分析12 批（编号为S1-S12）白花蛇舌草的色谱图。以S11为参照图谱，多点校正全峰匹配，12批白花蛇舌草HPLC 叠加指纹图谱见图1。标定了17个共有峰，以对照图谱为参照进行相似度计算，12批白花蛇舌草的相似度分别为 0.735，0.717，0.755，0.763，0.862，0.818，0.835，0.849，0.942，0.936，0.953，0.937，表明12 批白花蛇舌草在生长期、开花期、结果期3 个不同生长阶段间存在一定差异。

图1 12批白花蛇舌草高效液相色谱叠加指纹图谱Fig.1 HPLC superimposed fingerprint of 12 batches of Hedyotis diffusa

相对保留时间和相对峰面积：12批（编号为S1-S12）白花蛇舌草指纹图谱中，各共有峰相对保留时间的RSD为0.21%～1.83%，共有峰相对峰面积的RSD为3.73%～39.18%，表明12 批白花蛇舌草共有峰的出峰时间相对稳定，峰面积相差较大，白花蛇舌草不同生长阶段间存在差异。

共有峰指认及相关分析：通过保留时间指认出7个色谱峰，分别为3 号峰去乙酰车叶草酸酐（保留时间7.896 min）、5 号峰4- 香豆酸（保留时间17.058 min）、11 号峰车叶草苷（保留时间32.288 min）、12 号峰阿魏酸（保留时间37.045 min）、15 号峰芦丁（保留时间45.187min）、16 号峰槲皮素（保留时间48.966 min）、17 号峰山柰酚（保留时间53.884 min）。详见图2。

图2 混合对照品溶液高效液相色谱图Fig.2 HPLC chromatograms of mixed reference solution

2.5 PCA

采用SPSS 24.0统计学软件分析，导入17个共有指纹峰数据，采用因子分析项下PCA 分析12 批不同生长阶段白花蛇舌草的主成分，并生成因子得分系数（FACn）。将提取的3 个主成分（特征值 >1.0）通过权重系统组合，可得综合得分公式F=0.513f1+0.196f2+0.102f（3f代表3个主成分得分）。F值越高，白花蛇舌草指纹图谱综合得分越高。由表2可知，白花蛇舌草3个生长阶段的综合质量排序为结果期>开花期>生长期。

表2 主成分因子得分系数及综合得分Tab.2 Factor score coefficients and comprehensive scores of PCA

2.6 OPLS-DA

为快速识别出3 个不同生长阶段白花蛇舌草指纹图谱的相似性和差异性，筛选出差异性成分，将17个共有指纹峰面积导入SIMCA 16.0 软件，对12 批白花蛇舌草进行OPLS-DA。结果见图3 和图4。为综合分析白花蛇舌草不同生长阶段的差异性，提取3 个主成分，设置分类Y矩阵变量随机排列进行置换检验，结果见图5。模型解释率参数（R2）= 0.984 > 0.5，预测能力参数（Q2）=0.968 > 0.5，表明所建模型预测能力较强；R2拟合直线和Q2拟合直线在Y坐标轴的截距分别为0.041 1 和-0.349 0，表明所建模型不存在过拟合现象。

图3 OPLS-DA荷载散点图Fig.3 Loading plot of OPLS - DA

图4 OPLS-DA VIP图Fig.4 VIP plot of OPLS - DA

图5 OPLS-DA模型置换检验图Fig.5 Permutation test of OPLS - DA

由图3 可知，OPLS - DA 模型中所有数据点均在95%置信区间内，表明生长期、开花期、结果期3个生长阶段白花蛇舌草的化学成分及含量存在一定差异，但同一生长阶段样品的相似度高。由图4可知，峰13、峰12、峰4、峰16、峰3、峰17 的变量重要性投影值（VIP）均大于1，分别为2.02，1.64，1.23，1.19，1.08，1.01，即为差异标志物，这6 个化合物对结果权重的影响率大于50%。因此，引起不同生长阶段白花蛇舌草含量差异的主要标志性成分分别为峰13、峰12（阿魏酸）、峰4、峰16（槲皮素）、峰3（去乙酰车叶草酸酐）、峰17（山柰酚）。

3 讨论

3.1 色谱条件优化

最佳检测波长选择：用DAD 对车叶草苷、去乙酰车叶草酸酐、4 - 香豆酸、阿魏酸、槲皮素、山柰酚对照品甲醇溶液的紫外- 可见光（200～400 nm 波长范围内）进行全波长扫描，得到最大波长分别为车叶草苷及去乙酰车叶草酸酐（λmax= 238 nm），4 - 香豆酸（λmax=306 nm），阿魏酸（λmax=323 nm），槲皮素、芦丁及山柰酚（λmax=369 nm），故选择分段变换波长检测法检测上述7种成分。

流动相选择：由于白花蛇舌草中7种化学成分的极性相差较大，本研究中选用不同流动相体系［乙腈-水溶液、甲醇-水溶液、乙腈-醋酸溶液（0.10%，0.15%，0.20%）］进行梯度洗脱，以优化色谱条件。结果表明，流动相体系为乙腈-醋酸溶液时对色谱峰峰形和保留时间均有明显影响。不加醋酸时，色谱峰出现不同程度拖尾；加入醋酸后，随着浓度的增加，色谱峰的对称性增加。考虑到色谱柱的耐酸范围，最终选择乙腈-0.15%醋酸溶液为流动相。

3.2 化学模式识别分析

指纹图谱作为一种综合的可量化技术手段，能反映中药内在化学成分的多变量信息和数据，但目前所采用的指纹图谱相似度评价系统缺乏多维立体性［12-13］。化学模式识别技术可迎合指纹图谱的整体性和模糊性要求，利用统计学软件对所含成分进行分类，可对指纹图谱进行多维综合分析，实现数据的识别功能［14-15］。本研究中通过PCA 模型间接反映了不同生长阶段白花蛇舌草的综合质量；OPLS-DA 模型判别出白花蛇舌草生长期、开花期、结果期3 个生长阶段的指纹图谱，筛选出6 个差异标志物，并通过对照品比对确认出4 种成分，分别为3 号峰去乙酰车叶草酸酐、12 号峰阿魏酸、16号峰槲皮素、17号峰山柰酚。

3.3 方法评价

本研究中建立了3个生长阶段白花蛇舌草的HPLC指纹图谱分析方法，确定出了17个共有指纹峰，经化学模式识别技术确定最佳采收期为结果期，并筛选出6个差异标志物，可为完善白花蛇舌草的质量标准提供参考。