基于网络药理学探讨隔山消积颗粒治疗功能性消化不良的物质基础及作用机制*

潘大波 ，姜德文 ，龙治峰 ，李小飘 ，王小霞 ，何文生

（1. 黔东南民族职业技术学院，贵州 凯里 556001； 2. 重庆市大足区人民医院，重庆 402360）

功能性消化不良（FD）是常见的功能性胃肠道疾病，多表现为早饱、上腹痛等［1］，在普通人群中的发病率为5%～20%［2］。FD 发病机制复杂，病程较长，易反复发作，严重影响患者的生活质量［3］。中医认为，FD 与“胃脘痛”“胃痞”“胃满”的临床症状相似。中医治疗FD 临床疗效显著，中药较缓和，长期服药毒副作用小，患者临床症状改善明显［4］。目前，用于治疗FD的中药方剂有三仁汤、半夏泻心汤、复方藏茴香和枳实消痞丸等。苗药复方隔山消积颗粒（以下简称苗药复方）由隔山消和马兰草2 味苗药配伍。方中，隔山消具有补肝肾、强筋骨、益精血、健脾消食、解毒疗疮功效；马兰草又名鱼鳅串、路边菊等，有理气、消食、清利湿热之功效，用于治疗胃脘胀痛、痢疾、水泻、尿路感染等。本研究中采用网络药理学和分子对接技术，从苗药复方多成分、多靶标的视角阐明其治疗FD 的物质基础与作用机制，为后续研究提供理论基础。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 活性成分筛选

通过SciFiner、中国知网、万方、维普数据库检索获取苗药复方中隔山消、马兰草的化学成分。隔山消Cynanchum wilfordii是萝藦科鹅绒藤属植物，其基源植物有耳叶牛皮消Cynanchum auriculumRoyle ex Weight.、隔山 牛 皮 消Cynanchum wilfordii（Maxim.）Hemsl和戟叶牛皮消Cynanchum bungei，且隔山消与传统中药白首乌的主要来源一致，故以“隔山消”“Cynan⁃chum wilfordii”“ 耳 叶牛 皮消 ”“ 隔山 牛皮 消 ”“戟 叶 牛皮消”“白首乌”为关键词检索获取隔山消的化学成分；马兰草为马兰Kalimeris indica（L.）Sch - Bip 的干燥全草，故以“马兰”“Kalimeris indica”“马兰草”为关键词检索获取马兰草的化学成分。运用ADMETlab 2.0 软件（https：// admetmesh. scbdd. com/）［5］在线预测其化学成分的性质，选取人体肠道吸收（HIA）在0～3 且符合Lipinski Rule（MW ≤ 500，logP ≤ 5，Hacc ≤ 10，Hdon ≤ 5，满足3个及以上条件）的化学成分作为苗药复方的活性成分。

1.2 活性成分靶标预测及FD 疾病靶标

采用基于配体的靶标预测在线服务器SwissTarget⁃Prediction［6］预测苗药复方活性成分的作用靶标。以“Functional dyspepsia”作为关键词，分别在GenCLip 3数据库（http：//ci.smu.edu.cn/genclip3/analysis.php）［7］和 GeneCards 数据库（https：// www. genecards. org/）［8］检索收集靶标，合并去重后运用Uniprot数据库（https：//www.uniprot.org/）校正整合，获得FD 相关靶标。将FD疾病靶标与苗药复方活性成分作用靶标进行叠合，获得苗药复方活性成分治疗FD的靶标。

1.3 药味-活性成分-治疗FD 靶标相互作用网络

将获得的苗药复方活性成分治疗FD 的靶标映射到相应活性成分中，获得活性成分与其对应治疗FD 靶标信息。采用Cytoscape 3.8软件［9］构建苗药复方药味-活性成分 - 靶标相互作用网络，运用插件Centi⁃ScaPe2.2 分析，提取网络中度值大于中介值的节点作为关键节点，即苗药复方治疗FD 的关键活性成分及关键作用靶标。

1.4 关键靶标-靶标相互作用网络构建

将获得的苗药复方治疗FD 的关键作用靶标导入String 11.5 数据库（https：/ /string-db.org/）［10］，预测靶标与靶标间的相互作用，选取有证据的相互作用进行分析。运用Cytoscape 3.8软件进行可视化显示。

1.5 关键靶标GO 聚类分析和KEGG 通路富集分析

将获得苗药复方治疗FD 的关键作用靶标导入David 6.8 数据库（https：// david. ncifcrf. gov/）［11］进行GO 聚类分析和KEGG 通路富集分析。选取同时≥4 个基因且P<0.05的项目进行分析。

1.6 分子对接

选取度值排名靠前的苗药复方治疗FD 的关键作用靶标，运用Autodock vina 软件［12］将苗药复方活性成分对接到上述靶标中，考察活性成分与靶标的结合亲和力及作用模式，对接打分热图用TBtools［13］显示。

2 结果

2.1 活性成分及其作用靶标

通过文献检索，收集到隔山消和马兰草的化学成分分别为116个和114个。隔山消的化学成分主要为C21甾苷类、多糖类、苯酮类等，马兰草的化学成分主要为黄酮类、酚酸类、三萜类、挥发油等。采用Chemdraw 2015软件绘制上述化学成分的结构并用ADMETlab 2.0软件在线预测其性质，选取HIA 在0～3 且符合Lipinski Rule（MW ≤ 500，logP ≤ 5，Hacc ≤ 10，Hdon ≤ 5，满足3个及以上条件）的化合物。符合条件的隔山消和马兰草的化学成分分别有35 个和71 个，其中1 个活性成分（β-谷甾醇）相同，即得到105个苗药复方活性成分。

采用SwissTargetPrediction 数据库预测其作用靶标，4 个化学成分（Diallyl carbonate，cynabungolide，coniferylalcohol和3，7，11-trimethyl-1，6-dodecadien-3，10，11 - triol）未预测到靶标，共作用于 821 个靶标，即101个化学成分作用于821个靶标。

2.2 FD 相关靶标

运用“Functional dyspepsia”作为关键词在GenCLiP 3数据库中检索到127 个靶标、GeneCard 数据库中大于Relevance score 中介值（2.87）的靶标 1 267 个，Uniprot数据库标准化且去重后得到FD 相关靶标1 304 个。将FD 相关靶标与苗药复方活性成分预测靶标叠合，得到共有靶标293 个（图1），即293 个靶标可能是苗药复方治疗FD的作用靶标。

图1 苗药复方活性成分预测靶标与FD相关靶标韦恩图Fig.1 Venn diagram of predicted targets of active ingredients of Miao medicine compound Geshan Xiaoji Granules and FD - related targets

2.3 药味-活性成分-靶标相互作用网络

将2.2 项下的共有靶标映射到100 个活性成分（其中1 个活性成分未找到），即苗药复方的100 个活性成分通过作用于293 个靶标发挥治疗FD 作用。获得由2 442 条边、395 个节点（其中，药味 2 个、活性成分 100个、靶标293 个）组成的苗药复方药味-活性成分-靶标相互作用网络。

度值不低于40的活性成分有20个（表1），其中来源于隔山消8个、马兰草12个。度值排名前10的化学成分有12-O-ikemaoyl-20-dihydro-lineolon、告达亭、芫花素、开德苷元、罗索他明、汉黄芩素、千层纸素A、山柰酚-7-葡萄糖苷、methyltrans-ferulate和加加米宁。

表1 度值不低于40的活性成分Tab.1 Active ingredients with a degree ≥40

度值不低于22 的靶标有20 个（表2），度值排名前10 的靶标为细胞色素P450 19A1（CYP19A1）、雄激素受体（AR）、碳酸酐酶Ⅱ（CA2）、雌激素受体β（ESR2）、睾丸特异性雄激素结合蛋白（SHBG）、雌激素受体α（ESR1）、HMG-CoA 还原酶（HMGCR）、花生四烯酸5-脂肪氧化酶（ALOX5）、聚［ADP - 核糖］聚合酶 - 1（PARP1）和乙酰胆碱酯酶（ACHE）。选取度值大于中介值（12.364 5）的节点作为关键节点，提取关键节点间的相互作用网络（图2），共2 个药味、70 个化学成分、61 个靶标和125 1条边。

图2 苗药复方隔山消积颗粒药味-活性成分-靶标相互作用网络Fig.2 Drugs-active ingredients-targets interaction network of Miao medicine compound Geshan Xiaoji Granules

表2 度值不低于22的靶标Tab.2 Targets with a degree ≥22

2.4 靶标- 靶标相互作用网络

将61个关键靶标导入Srting数据库，用Centoscape 3.8软件绘制靶标- 靶标相互作用网络（图3）。度值大于20 的靶标有17 个，排名靠前的有表皮生长因子受体（EGFR）、酪氨酸蛋白激酶（SRC）和环加氧酶2（PTGS2）等。

图3 靶标-靶标相互作用网络Fig.3 Targets-targets interaction network

2.5 靶标功能GO 聚类分析和KEGG 通路富集分析

将从苗药复方药味-化学成分-靶标相互作用网络提取的61个关键靶标导入David数据库进行GO功能聚类和KEGG通路富集分析，满足≥4个基因且P<0.05的细胞组成（CC）、生物过程（BP）和分子功能（MF）的分别得到18，74，35条项目。CC 主要集中在nucleus（核）和nucleoplasm（核质）等，BP主要集中在signal transduction（信号转导）和negative regulation of apoptotic process（凋亡过程的负调控）等，MF 主要集中在protein binding（蛋白质结合）和ATP binding（ATP 结合）等，苗药复方关键作用靶标的GO 聚类分析见图4。提示苗药复方活性成分通过作用于细胞核、细胞核质及细胞膜等影响能量代谢、蛋白结合等，调控信号转导和蛋白质磷酸化等，达到治疗FD的目的。

图4 苗药复方关键作用靶标的GO聚类分析Fig.4 GO clustering analysis of key targets of Miao medicine compound Geshan Xiaoji Granules

满足 ≥ 4 个基因且P<0.05 的 KEGG 通路有 85 条，其中与FD 相关的靶标调控的通路为Fc γ R 介导的吞噬作用（Fc gamma R-mediated phagocytosis）、逆行内源性大麻素信号（retrograde endocannabinoid signaling）、胆碱能突触（cholinergic synapse）、Toll 样受体信号通路（toll-like receptor signaling pathway）、自然杀伤细胞介导的细胞毒性（natural killer cell mediated cytotoxicity）、TRP 通道的炎性介质调节（inflammatory mediator regula⁃tion of TRP channels）和花生四烯酸代谢（arachidonic acid metabolism）等。苗药治疗FD 的KEGG 通路富集分析结果见图5。

图5 苗药复方治疗FD的KEGG 通路富集分析Fig.5 KEGG pathway enrichment analysis of Miao medicine compound Geshan Xiaoji Granules in the treatment of FD

2.6 分子对接分析

选取苗药复方药味-活性成分-靶标相互作用网络中靶标度值较大，且与目前研究发现FD 的发病因素关系较大的靶标CA2，HMGCR，ALOX5，PTGS2，ACHE作为受体（表3），将苗药复方活性成分作为配体对接到受体中，分子对接打分热图见图6。

图6 苗药复方活性成分分子对接打分热图Fig.6 Heat map of the molecular docking scoring of active ingredients of Miao medicine compound Geshan Xiaoji Granules

表3 分子对接的FD相关的靶标蛋白Tab.3 FD-related target proteins in the molecular docking

对接打分低于-8.0 kcal/mol的活性成分-靶标作用有119 对，其中打分最好的是活性成分cynandione E（白首乌酮E）与ACHE 间的作用，为 - 11.4 kcal/ mol。为进一步探讨靶标与活性成分的相互作用模式，分别选取每个靶标与活性成分打分最优的组合进行分析（图7）。

与CA2 结合最好的活性成分为加加米宁，对接打分为 - 9.3 kcal/ mol。加加米宁（gagamine）与 CA2 和THR200 形成 1 个氢键、ASN62 侧链氨基形成 2 个氢键、ASN67侧链羰基形成2个氢键，共5个氢键，与HIS64和HIS94 形成π - π 堆积作用（图7 A）。在HMG - CoA 还原酶体系中，与青阳参苷元（qingyangshengenin）对接打分为- 8.8 kcal/ mol。由于青阳参苷元含有羟基较多，与HMG-CoA 形成很强的极性相互作用，共存在11 个氢键（图7 B）。α-香树脂醇（α-amyrin）嵌入ALOX5口袋中，与ASN554形成2个氢键（图7 C）。cynandione E 与ACHE 的对接打分为 - 11.4 kcal/ mol。cynandione E 占据ACHE的2个活性空腔，且在2个空腔均与ACHE有氢键作用，即与SER293，PHE295，TYR341，THR75形成5个氢键（图7 D）。大黄酚（chrysophanol）很好嵌入PTGS2 活性口袋中，与SER530和TYR355形成2个氢键（图7 E）。

图7 苗药复方活性成分与靶标作用分子对接模式Fig.7 Molecular docking mode of the active ingredients of Miao medicine compound Geshan Xiaoji Granules and targets

3 讨论

研究表明，FD的发病原因包括胃肠动力障碍、内脏高敏感性、脑- 肠轴功能紊乱、精神心理因素、十二指肠黏膜屏障受损、低度炎症和肠道菌群失调等。苗药复方由苗族常用药隔山消和马兰草配伍，采用水煎煮制备而成，具有消积行气功效，用于脾胃气滞所致的食积内停、脘腹胀痛等。

本研究结果显示，苗药复方隔山消积颗粒中有100个活性成分与FD 相关的293 个靶标作用。上述靶标主要 集 中 在 AR，ESR2，ESR1，CA2，HMGCR，ALOX5，ACHE 等。其中，AR 能通过调控 Bmp 分泌，调控 Wnt 信号而控制肠干细胞增殖［14］；ESR1 和 ESR2 与胃食管反流病、食管癌、消化性溃疡、胃癌、炎性肠病、肠易激综合征和结肠癌的发生关系密切［15］；CA2 主要分布在胃肠道、肾远曲小管等，与消化系统炎症相关［16］；HMGCR抑制剂对幽门螺杆菌诱导的胃炎模型小鼠具有抗炎作用［17］；ALOX5是花生四烯酸合成白三烯的关键酶，产物白三烯与炎性疾病密切相关，包括胃炎、哮喘等［18］；ACHE 抑制剂阿考替胺能通过抑制ACHE 的活性来增强胃肌肉收缩，提高胃动力［19］。选择性PTGS2抑制剂不影响胃十二指肠黏膜，同时具有与非选择性非甾体抗炎药（NSAID）相似的抗炎和镇痛功效［20］。上述靶标主要调控幽门螺杆菌感染中的上皮细胞信号传导、胆碱能突触、肿瘤坏死因子（TNF）信号通路和花生四烯酸代谢等通路，涉及炎症、脑- 肠轴功能紊乱、精神心理因素等，与FD的发生、发展密切相关。

由表1可知，苗药复方活性成分-靶标相互作用网络获得度值大于40的20个活性成分有告达亭、开德苷元、加加米宁、汉黄芩素、neoechinulin A和大黄素甲醚。其中，告达亭在隔山消的含量为（1.354 ± 0.609）μg/g［21］，从5.7 kg 耳叶牛皮消中可提取80 mg 告达亭、32 mg 开德苷元和 50 mg 加加米宁［22］；从 20 kg 马兰全草中可提取汉黄芩素22 mg、千层纸素A 6 mg、7，4'-二羟基异黄酮10 mg［23］；从 15 kg 马兰全草中可提取芫花素 22 mg、aurantiamide金色酰胺醇10.5 mg、neoechinulin A 16.3 mg、邻苯二甲酸二丁酯 5.6 mg、大黄素甲醚 53.4 mg［24-26］；从11 kg 马兰中可提取山柰酚-7-葡萄糖苷3.31 ng、methyltrans- ferulate 3.8 mg、槲皮素 6.3 mg、山柰酚5.7 mg［27］。在隔山消或马兰草中的含量较大，均超过1 mg/kg，可能是苗药复方的特异性成分。

隔山消中的C21甾苷类活性成分在治疗FD中起着关键作用。白首乌提取物能调控Toll 样受体4/骨髓分化因子88/核转录因子κB（TLR4/MyD88/NF- κB）信号通路，抑制炎性反应［28］。C21 甾苷类成分能上调核因子E2 相关因子2（Nrf2）和血红素氧合酶 - 1（HO - 1），抑制H2O2诱导的氧化损伤和炎性反应，其中告达亭能减轻肝中的炎性症状，下调白细胞介素6（IL-6）、白细胞介素1β（IL-1β）和单核细胞趋化因子的表达［29］。加加米宁抑制脂质过氧化物的形成，具抗氧化性［30］，且抑制5 - 脂肪氧化酶的半数抑制率（IC50）为26 μmol/ L。千层纸素A 通过保护肠黏膜和改变肠道微生物群来缓解结肠炎［31］。马兰草中的汉黄芩素激活Nrf2，促进抗氧化酶包括醌氧化还原酶-1（NQO-1）、谷胱甘肽硫转移酶（GST）、HO-1、超氧化物歧化酶1（SOD1）和超氧化物歧化酶2（SOD2）在肝细胞中的表达，并抑制NF-κB 调节的促炎信号传导，即通过激活Nrf2 的同时改善氧化应激和炎性反应［32］。槲皮素可抑制ERK和p38MAPK 的磷酸化，稳定 NF - κB/IκB 而阻止IκB 的脱落，抑制下游IL - 1β，IL - 6，TNF - α，NO/ iNOS 的表达，降低炎性因子的水平，同时能抑制COX - 2 的表达［33］。Cynan⁃dione A 通过调控 α7 - nAChR 依赖性 IL - 10/ β - 内啡肽信号通路抑制神经性疼痛［34］。隔山消积颗粒的活性成分通过作用于胃肠道炎性相关靶点IL-6，IL-1β，TNF - α，5 - 脂肪氧化酶，ESR2，ESR1，CA2，AR，HMGCR和ALOX5等，促进胃动力靶点和神经调控靶点ACHE等，通过调控炎性信号通道TLR4/MyD88/NF-κB、脑- 肠轴功能紊乱、胃肠动力障碍和精神心理因素等相关通路达到治疗FD的作用。