三峡消落带落羽杉茎段外植体扩繁技术研究

陈雪梅，陈春桦，杨治华，袁中勋，陈张婷，李昌晓

1. 西南大学 生命科学学院， 重庆 400715；2. 重庆市北碚区王朴中学校， 重庆 400717

三峡工程完全建成后， 在“冬蓄夏排”的水位调度方式下， 形成了垂直落差达30 m的消落带． 库区消落带原有的植物因受到长时间反季节水淹而大量消亡， 进而导致消落带生物多样性降低， 水土流失加剧， 生态屏障功能减退． 研究表明人工植被修复与重建是恢复消落带植被的有效方法． 落羽杉Taxodiumdistichum(L.) Rich.耐水淹能力强， 在三峡消落带的生长表现良好， 是消落带植被修复重建的首选树种之一[1-4]， 目前已被广泛用于消落带植被修复重建项目中． 然而， 当前用于消落带植被修复重建的落羽杉苗木基本上来自省外采购， 病虫害发生率较高， 苗木质量参次不齐， 一级苗占比较低， 运输、 栽植及管护成本居高不下． 落羽杉为杉科(Taxodiaceae)落羽杉属(TaxodiumRich.)落叶性大乔木， 树干通直， 基部常较粗大， 原产地位于北美， 现已广泛引种到世界各地[5]． 落羽杉的种子繁殖实验表明， 因种皮太厚且种子具有明显锐利的棱脊， 发芽率低， 利用种子大规模繁殖较为困难[6]． 与此同时， 落羽杉的扦插繁殖也存在插穗数量受限、 时间耗费较长、 成本较高、 采条部位对插苗的性状表现影响较大等诸多问题[7]． 因此， 组织培养已经成为落羽杉种苗扩繁的重要途径． 如果将长期处于三峡库区消落带水淹—落干—水淹—落干逆境条件且已完全适应的落羽杉人工林作为组培外植体， 无疑将会明显加快所需落羽杉种苗的繁育速度并提高繁育成效． 组织培养繁殖速度快、 不受季节限制、 能保存母本的全部优良性状[8-12]． 在组织培养时， 对于不同物种外植体的选取不尽相同[13-14]， 通常用于组织培养的外植体主要有胚轴、 叶片、 叶柄、 茎段等． 目前落羽杉的组织培养多采用种子成熟胚或幼苗为外植体[15-16]， 这对于三峡库区消落带而言， 这些外植体来源受到明显的限制(种子及幼苗极少)． 相反， 如果以三峡库区消落带现有长势良好的落羽杉茎段为外植体来源， 则可以获得大量来自于消落带原位生境的组培材料， 进而为三峡库区消落带提供大量落羽杉良种壮苗， 为三峡库区消落带生态修复与重建所需种苗做出切实贡献． 当前， 有关以三峡库区消落带现有适生的落羽杉茎段为外植体来源进行组培的研究还未见报道． 因此， 本文以生长于三峡库区消落带原位的10年生落羽杉优株为试验材料， 选取落羽杉茎段为外植体进行组织培养， 探索三峡库区消落带落羽杉外植体的最佳组培实践技术， 以期为三峡库区消落带原位生长的落羽杉优株快速扩繁提供技术支撑．

1 材料与方法

1.1 外植体类型的筛选

试验材料选自三峡库区重庆市忠县石宝镇汝溪河消落带落羽杉人工林． 在165～175 m海拔之间选择长势良好的10年生落羽杉随机剪取树冠中部的当年生未木质化枝条、 半木质化枝条， 长约15 cm， 及时喷水保湿， 24 h内带回实验室处理． 剪去针状叶片， 用洗衣粉清洗3遍， 置于水龙头下冲洗2 h． 用75%的乙醇漂洗30 s， 无菌水冲洗3次， 再用0.1% HgCl2消毒3 min， 无菌水冲洗3～5次， 切割成2～3 cm的茎段， 接种到MS培养基上． 本试验随机设置3个重复小区， 每个小区接种外植体70个， 每个处理共接种外植体210个， 培养15 d后观察统计外植体的存活率和污染率．

1.2 外植体部位的筛选

根据1.1试验结果， 选取最佳外植体类型， 消毒方法同1.1， 将其切割分为上、 中、 下3部分， 分别接种到MS培养基上． 随机设置3个重复小区， 每个小区接种外植体16个， 每个处理共接种外植体48个， 培养15 d后观察统计外植体的存活率和污染率．

1.3 表面消毒剂和消毒时间的筛选

根据1.2试验结果， 选取明确的最佳外植体部位， 在无菌条件下， 先用75%的乙醇消毒不同时间(10 s， 20 s， 30 s， 40 s)， 无菌水冲洗3次后接种到MS培养基中． 选择乙醇的最佳消毒时间进行第1次消毒后分别用2% NaCIO， 5% NaCIO， 0.1% HgCl2消毒不同时间(1 min，1.5 min，2 min，2.5 min，3 min)， 无菌水冲洗3～5次． 切割成2～3 cm长的茎段， 接种于MS培养基中． 随机设置3个重复小区， 每个小区接种外植体8个， 每个处理共接种24个外植体， 培养15 d后观察统计外植体的存活率和污染率．

1.4 抑菌剂的筛选

选取1.2试验结果中最佳外植体部位， 选取1.3中明确的最佳消毒方法， 培养基中分别加入PPM(0.1%， 0.2%， 0.4%)和益培灵(0.05 g/L， 0.1 g/L， 0.2 g/L)， 随机设置3个重复小区， 每个小区接种外植体8个， 每个处理共接种24个外植体， 培养25 d后观察统计外植体的存活率和污染率．

1.5 落羽杉茎段腋芽的诱导

选取1.2试验结果中最佳外植体部位， 选取1.3中明确的最佳消毒方法， 之后切成2～3 cm的茎段， 培养基中加入0.2% PPM， 接种到以下含不同植物生长调节剂的培养基中： MS+激动素(KT)(0.5 mg/L， 1 mg/L， 2 mg/L)+萘乙酸(NAA)(0.1 mg/L， 0.2 mg/L， 0.4 mg/L)． 随机设置3个重复小区， 每个小区接种外植体8个， 每个处理共接种24个外植体， 培养60 d后统计腋芽的诱导率、 繁殖系数和生长状况．

1.6 落羽杉丛芽诱导

诱导出的茎段腋芽约长至2 cm时， 接种到以下含不同植物生长调节剂的培养基中， DCR+6-苄氨基嘌呤(6-BA)(0.5 mg/L， 1 mg/L)+吲哚丁酸(IBA)(0.2 mg/L， 0.4 mg/L， 0.6 mg/L)；1/2 MS+6-BA(0.5 mg/L， 1 mg/L)+IBA(0.2 mg/L， 0.4 mg/L， 0.6 mg/L)， 均去除细胞分裂素浓度低于生长素浓度的组合． 随机设置3个重复小区， 每个小区接种外植体4个， 每个处理共接种12个外植体， 培养60 d后统计丛芽的诱导率、 繁殖系数和生长状况．

1.7 培养条件

培养基含蔗糖30 g/L， 琼脂6.5 g/L， pH值为5.8． 培养温度为(25±1)℃， 光照强度为30 μmol/(m2·s)， 光照时间12 h/d．

1.8 数据处理

用Microsoft Excel 2010和SPSS 22.0 软件对测定的原始数据进行处理， 采用独立样本t检验和单因素方差(One-way ANOVA)进行统计分析． 单因素方差分析采用Duncan多重比较(Duncan’s multiple range test)进行显著性检验， 显著性水平设为α=0.05． 所有图像均用Origin 9.0(Origin lab Corporation)软件制图．

2 结果

2.1 落羽杉外植体类型的筛选

从表1可以看出， 未木质化茎段的存活率和污染率与半木质化茎段差异有统计学意义． 半木质化茎段的污染率达到了71.24%， 而未木质化茎段的污染率却只有21.91%， 提高了2.25倍． 试验观察记录也发现， 半木质化茎段绝大部分长菌， 未木质化茎段长菌较少． 与此同时， 半木质化茎段的存活率只有19.05%， 与未木质化茎段的存活率达到60%相比， 降低了2.15倍． 因此， 以存活率和污染率综合评判， 未木质化茎段为最佳的外植体类型．

表1 不同外植体类型的污染率和成活率

2.2 外植体部位的筛选

将外植体切割成上、 中、 下3部分之后， 分别接种于培养基中， 培养15 d后观察统计外植体的存活率和污染率． 对存活率和污染率方差分析结果进行比较发现(表2)， 3个部位茎段的存活率相互之间差异无统计学意义；尽管中部茎段的存活率最高且达到41.67%， 但与上部和下部茎段的存活率相差不大． 相反， 下部茎段的污染率和上部、 中部茎段相比差异均具有统计学意义， 下部茎段污染率为50.00%， 达到最高， 显著高出中部0.33倍， 高出上部0.85倍． 因此， 基于存活率和污染率进行综合判定， 茎段中部为外植体最佳选取部位．

表2 外植体不同部位处理的存活率和污染率

2.3 表面消毒剂和消毒时间的筛选

经消毒处理的外植体在培养基中培养15 d后， 其存活率和污染率情况分别见表3和表4． 结果表明， 不同种类及浓度的消毒剂对外植体的污染率和存活率影响差异有统计学意义． 由表3可知， 用75%乙醇溶液漂洗30 s时存活率最高(29.17%)， 漂洗10 s， 20 s时外植体全部长菌污染死亡． 用75%乙醇溶液漂洗40 s时污染率最低(37.50%)， 但其存活率较30 s时有所下降． 由表4可知， 当用2% NaCIO消毒1 min， 1.5 min， 在第5d， 6 d时外植体就会全部长菌． 消毒时间延长至3 min时， 污染率依旧达到83.33%． 增加NaCIO的浓度到5%后， 在相同的消毒时间内， 随着NaCIO浓度的升高消毒效果明显增强， 消毒时间为3 min时效果最好， 污染率降到41.67%， 存活率也提高到45.83%． 用0.1% HgCI2漂洗1 min时外植体全部长菌， 随着HgCI2消毒时间的延长， 污染率逐渐降低， 漂洗3 min时是所有消毒处理中效果最好的， 污染率降至33.33%． 综上所述， 在本试验中， 先用75%乙醇漂洗30 s， 再用0.1% HgCI2消毒3 min是落羽杉茎段消毒的最佳处理方法．

表3 乙醇消毒时间对外植体消毒效果的影响

表4 消毒试剂次氯酸钠(NaCIO)与氯化汞(HgCI2)在不同消毒时间条件下对外植体消毒效果的影响

2.4 抑菌剂对外植体存活率和污染率的影响

将消毒过后的外植体接种至加入了抑菌剂的培养基中， 结果表明， 加入抑菌剂组和对照组(CK)相比存活率、 污染率差异均有统计学意义(表5)． 与对照组相比， 加入抑菌剂后的处理组污染率显著降低， 其中0.2% PPM组污染率最低， 只有16.67%． 尽管加入0.2 g/L益培灵处理组污染率最高， 达到33.33%， 但仍然显著低于对照组． 相应地， 各处理组存活率与对照组相比显著提高， 存活率提高最大的是培养基中加入0.2% PPM处理组， 其存活率达到75.00%， 高出对照组1.25倍；即使是存活率提高最低的0.05 g/L益培灵处理组， 存活率也达到了50.00%， 高出对照组0.5倍．

表5 不同抑菌剂对外植体存活率和污染率的影响

2.5 落羽杉茎段腋芽的诱导

将消毒过后的外植体接种到腋芽诱导培养基中， 结果表明， 不同植物生长调节剂种类和浓度组合显著影响茎段腋芽的诱导(表6)． 由表6可知， 与不加激素(图1a)相比， 单一激素也能诱导腋芽萌发， 并随着NAA浓度的升高萌发率也升高， MS+0.4 mg/L NAA处理组的萌发率达到25.00%． 混合激素对腋芽萌发的效果更好， 当KT浓度为0.5 mg/L时， 随着NAA浓度的升高， 腋芽萌发率和繁殖系数均升高， 萌发率最高达到66.67%(图1b)， 繁殖系数达1.50倍． 当KT浓度为2 mg/L时， 随着NAA浓度的升高， 腋芽萌发率和繁殖系数均下降， 萌发率最高为33.50%， 繁殖系数最高为1.00倍． 当NAA浓度为0.1 mg/L时， 随着KT浓度的升高， 萌发率和繁殖系数呈现先升高后下降的趋势， 当NAA浓度为0.2 mg/L和0.4 mg/L时， 萌发率和繁殖系数均随着KT浓度的升高呈现下降的趋势． 在本次试验中， 从繁殖系数和萌发率来看， 最适合落羽杉腋芽诱导的培养基为A6， 即MS+0.5 mg/L KT+0.4 mg/L NAA， 且腋芽生长较快， 其次为A5．

表6 不同植物生长调节剂对落羽杉茎段腋芽的诱导

图1 落羽杉茎段腋芽诱导

2.6 落羽杉丛芽诱导

以落羽杉腋芽(无菌苗)为外植体接种到设定的诱导培养基中进行培养， 结果表明， 不同基本培养基和不同植物生长调节剂种类、 浓度组合显著影响落羽杉丛芽的诱导(表7， 图2)． 比较B1-B6可知， 除B5外， 加入激素的处理组丛芽诱导率和繁殖系数均比不加激素的高；当6-BA浓度一定时， 丛芽的诱导率和繁殖系数随着IBA浓度的升高而降低；当IBA浓度一定时， 6-BA浓度越高诱导率和繁殖系数越低， 诱导率最高达75.00%， 繁殖系数最高为2.25倍． 比较B7-B12可知， 当6-BA浓度为0.5 mg/L时， 随着IBA浓度的升高， 诱导率和繁殖系数也升高． 当6-BA浓度为1 mg/L时， 随着IBA浓度的升高， 诱导率和繁殖系数先升高后降低． 当IBA浓度一定时， 诱导率和繁殖系数均随着6-BA浓度的升高而降低． 诱导率最高为83.33%， 繁殖系数最高为2.58倍． 综合繁殖系数、 丛芽诱导率、 单芽总数等指标， 腋芽丛芽在B8培养基中诱导率和繁殖系数最高， 显著高出其他处理组， 而且B8的丛芽长势和生长状态相较更好， 因此腋芽丛芽诱导最佳的培养基为B8， 即1/2 MS+0.5 mg/L 6-BA+0.4 mg/L IBA， 其次为B1和B3．

表7 不同植物生长调节剂对丛芽诱导的影响

图2 丛芽诱导

3 讨论

3.1 落羽杉茎段外植体的初代培养

试验研究发现， 与大多数植物一样， 在落羽杉组织培养过程中， 外植体污染是普遍遇到的难题， 若外植体材料污染的问题无法得到有效解决， 则将十分影响后续阶段培养步骤的进行[17-18]． 所以科学合理的消毒灭菌步骤显得尤为重要． 获取外植体的环境条件、 取材部位、 取材时间以及接种时操作是否规范都会对外植体的带菌情况造成影响， 尤其是长期生长在室外环境条件下的植物自身易携带大量的细菌微生物， 表面消毒时化学消毒剂很难将其彻底杀死[19-20]． 目前许多外植体消毒都是用单一的消毒剂进行消毒， 不能达到良好的效果． 组织培养常用的消毒剂有乙醇、 次氯酸盐、 HgCl2、 过氧化氢等． 75%的乙醇具有一定的杀菌力， 而且具有湿润作用， 可排除掉植物材料上的空气， 利于与其他消毒剂配合使用[21]． 次氯酸通过侵入细胞内与蛋白质发生氧化作用或破坏其磷酸脱氢酶， 使糖代谢失调而致细胞死亡；HgCl2中的Hg2+可与带负电的细菌蛋白质结合， 使蛋白变性， 酶蛋白失活， 进而使细胞致死[22]． 本试验采用了乙醇与HgCl2和NaCIO联合消毒的方式， 大大提高了消毒的效果． 试验结果显示， 2%的NaCIO灭菌效果差， 增大浓度到5%之后随着消毒时间的延长， 污染率出现明显的降低， 但在相同的消毒时间内效果不如0.1% HgCl2， 这与茶条槭(Acerginnala)外植体消毒效果相似[23]． 这极有可能是因为NaCIO灭菌作用较温和且容易去除， 配置后稳定性较差， 容易分解． 在试验过程中还发现， 虽然采取联合消毒的方式对外植体进行消毒的效果更好， 但总体的污染率还是很高， 部分外植体在接种1个月后有腋芽萌动时还会出现污染， 给后续试验带来很大程度的干扰． 因此， 在初代培养阶段的培养基中有必要加入一定浓度的植物抗菌剂来抑制外植体携带的各种微生物污染． 植物抑菌剂可以有效抵制酶催化作用， 影响菌体细胞壁的合成， 最终导致微生物生长受阻[24]． 加入抑菌剂后， 外植体污染率大大降低， 这与辣木(MoringaoleiferaLam.)结果相似[25]． 本次试验中虽然提高了NaCIO的浓度， 但是没有延长消毒时间， 在接下来的试验中我们将考虑延长NaCIO消毒的时间， 观察其灭菌效果．

3.2 落羽杉茎段腋芽的诱导

通过腋芽增殖和间接器官发生的方法建立腋芽增殖体系， 能否成功诱导出腋芽是其中关键的一步[26]． 在落羽杉茎段腋芽诱导阶段一般采用细胞分裂素与生长素相结合的办法． 落羽杉属常用的激素有6-BA， NAA， KT， ZT等[16， 27]． 在墨西哥落羽杉组织培养过程中发现其对6-BA的浓度变化较为敏感， 浓度达到1～2 mg/L就会出现诱导率降低， 甚至出现玻璃化、 白化芽的现象[28]． 激动素(Kinetin)是一种非天然的细胞分裂素， 它可以促进细胞分化、 分裂、 生长， 诱导组织长芽， 解除顶端优势． 它的活性比腺嘌呤更高， 一般用来促进生芽[29]． NAA是生长素的一种， 通过在植物体内促进一系列的合成反应， 进而促进蛋白质含量的上升， 蛋白质的积累有益于促进营养器官纵向生长[30]． KT与NAA的组合在落羽杉腋芽萌发过程中诱导率最高达66.67%， 几乎未出现玻璃化， 每个茎段产生腋芽数2～5个， 且在适宜的浓度下腋芽生长速度较快， 30 d左右腋芽能长至1～1.5 cm， 颜色嫩绿， 长势良好． 试验中还发现在低浓度的NAA中， 容易出现膨大的芽， 这与百合(LiliumL.)试管鳞茎结果相似[31]， 膨大的芽簇生在一起长势较慢．

3.3 丛芽诱导与褐化

针叶树种离体快繁在增殖诱导阶段时， 通常使用6-BA与IBA或6-BA与NAA的组合来诱导不定芽[32]． 不同生长调节剂的混合使用效果远优于单一激素[33-34]． 在这个阶段采用0.5 mg/L 6-BA和0.4 mg/L IBA组合丛芽诱导率最高， 这与墨西哥落羽杉幼苗为起始外植体的组培结果相似[28]． 在试验过程中我们发现， 落羽杉茎段组培芽在添加激素的条件下进行增殖培养30 d后会有丛芽产生， 多数单芽萌发多个丛芽， 但不添加激素时几乎没有丛芽产生． 落羽杉茎段组培芽培养30 d后， 部分芽苗叶缘慢慢发黄， 最终整个外植体枯黄死亡． 究其原因可能是木本植物本身含有较多的酚类物质， 将腋芽切割下来用于丛芽诱导时， 外植体细胞受到破坏， 细胞内的过氧化物酶、 多酚氧化酶等酶释放或合成， 在合适的pH值、 温度、 光照等条件下， 与细胞液泡里的酚类物质发生酶促氧化反应， 形成有毒的棕褐色醌类物质， 从而使组织发生褐变[35-36]． 随着培养时间的延长， 醌类物质逐渐积累， 最终导致整个外植体死亡． 在本试验中， 通过在培养基中添加不同浓度的吸附剂AC[37-38]， 褐化程度有一定的缓解， 但是随着培养时间的延长， 最终芽苗还是会枯黄死亡， 对于这个现象的解决办法还有待进一步的研究．

4 结论

本研究运用组织培养技术获得了一定数量的无菌外植体， 再通过腋芽诱导和丛芽诱导扩繁获得了无菌苗． 结果表明， 在落羽杉组培初代培养阶段外植体的存活率和污染率受外植体类型、 外植体部位、 消毒剂的种类、 消毒剂作用时间等多个因素的影响， 选择最佳的外植体以及消毒方式对之后的培养过程至关重要． 在本试验中采用乙醇与HgCl2和NaClO联合消毒并加入植物抑菌剂的方法， 显著提高了消毒的效果． 在腋芽诱导和丛芽诱导阶段， 不同植物生长调节剂以及浓度均显著影响其诱导率．