初诊弥漫大B细胞淋巴瘤患者骨髓来源抑制性细胞的亚群分布及功能异常分析

刘静茹，陈书铖，2，许凯明，陈加弟，黄慧芳

弥漫大B细胞淋巴瘤(diffuse large B cell lymphoma, DLBCL)是最常见的成人B细胞淋巴瘤，生长迅速，侵袭性高，近半数患者治疗后发生耐药，转变为复发或难治型，成为目前DLBCL临床治疗中亟待解决的难点[1]。针对DLBCL的免疫监测和免疫治疗为该病的诊疗提供了新手段[2]。骨髓来源抑制性细胞(myeloid-derived suppressor cell, MDSC)是一类来源于骨髓且具有免疫抑制功能的细胞[3]。人体内MDSC可分为单核细胞性骨髓来源抑制性细胞(monocyte myeloid-derived suppressor cell，M-MDSC)和粒细胞性骨髓来源抑制性细胞(granulocyte myeloid-derived suppressor cell，G-MDSC)两大亚群，不同亚群的免疫抑制机制有所不同[4]。MDSC异常扩增和聚集可以削弱机体的免疫应答能力，导致免疫治疗效力下降[5]。作为潜在的临床标志物和治疗靶点，目前文献报道[6-7]多关注于M-MDSC 与实体肿瘤疾病的临床相关性，对 DLBCL患者的骨髓和外周血中M-MDSC与G-MDSC表达差别及其功能在DLBCL中扮演的角色尚无一致的结论。本研究采用多色流式细胞术分析初诊DLBCL患者和健康供者外周血、骨髓标本中的M-MDSC 和G-MDSC两大亚群的分布差别，同时检测其功能，探讨DLBCL患者免疫微环境异常的机制。

1 对象与方法

1.1 对象 收集50例初诊DLBCL患者和30例健康供者的外周血标本，10例初诊DLBCL患者和10例健康供者的骨髓标本。其中初诊DLBCL患者来自2021年8月—2022年5月就诊于福建医科大学附属协和医院(本院)且均符合DLBCL临床诊断标准[8](包括疾病分期、血清乳酸脱氢酶水平、有无B症状以及淋巴瘤IPI评分等内容)；健康供者外周血标本来源于本院健康体检中心，健康供者骨髓标本来源于本院移植中心。上述所有受检者均无传染性疾病、自身免疫性疾病和其他肿瘤疾病。本研究已通过本院伦理委员会批准(2021WSJK018)，患者均知情同意。

1.2 试剂与仪器 红细胞裂解液(北京天根生化科技有限公司)，磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution，PBS)(北京索莱宝科技有限公司)，活性氧(reactive oxygen species, ROS)试剂盒(上海碧云天科技有限公司)，胎牛血清和普通1640培养基(美国Gemini公司)，CD45-eFluor 506和CD15-eFluor 450单克隆抗体(美国Thermo-Fisher科技公司)，人Fc受体阻断剂、CD33-PerCP-Cy5.5、CD11b-PE及CD14-APC-Cy7单克隆抗体(美国Biolegend公司)，HLA-DR-APC和BD FACS Celesta分析型流式细胞仪(美国BD公司)。

1.3 外周血和骨髓MDSC亚群流式检测 收集研究对象的EDTA抗凝静脉血和肝素抗凝骨髓标本，从中吸取120 μL至流式管中，每管加入1 μL人Fc受体阻断剂以降低非特异性染色，放置室温孵育10 min 后直接加入HLA-DR-APC 10 μL，CD45-eFluor 506、CD15-eFluor 450、CD33-PerCP-Cy5.5、CD11b-PE及CD14-APC-Cy7抗体各2.5 μL，放置4 ℃ 孵育30 min，用PBS(含2%胎牛血清)洗涤1次，1 400 r/min离心5 min，弃上清液。每管加入3 mL 红细胞裂解液，放置4 ℃裂解25 min，1 400 r/min 离心5 min，弃上清液，用PBS(含2%胎牛血清)洗涤1次，加入500 μL PBS(含2%胎牛血清)重悬细胞。本研究以CD45+HLA-DR-CD33+CD11b+CD14+CD15-作为M-MDSC的免疫表型；以CD45+HLA-DR-CD33+CD11b+CD15+CD14-作为G-MDSC 的免疫表型，通过BD FACS Celesta流式细胞仪分别检测各标本中M-MDSC和G-MDSC两大亚群，采用Flowjo V10.8.1软件分析相关数据，以M-MDSC和G-MDSC占CD45+细胞中比例作为最终数据统计结果。

1.4 DCFH-DA探针法检测外周血M-MDSC和G-MDSC的ROS表达 采用普通1640培养基按照1∶1 000稀释DCFH-DA探针，使其终浓度为10 μmol/L；收集研究对象的外周血标本，使其悬浮于稀释过的DCFH-DA探针中，调整细胞浓度为1×106mL-1，放置37 ℃细胞培养箱孵育20 min，每隔5 min颠倒混匀，使细胞与探针充分接触。采用普通1640培养基洗涤细胞3次，充分去除游离的DCFH-DA探针。收集细胞进行MDSC流式抗体染色(方法同外周血和骨髓MDSC亚群流式检测)，通过BD FACS Celesta流式细胞仪检测各标本中M-MDSC和G-MDSC的ROS表达水平，采用Flowjo V10.8.1软件分析相关数据，以平均荧光强度(mean fluores cence intensity，MFI)作为最终数据统计结果。

2 结 果

2.1 MDSC及其亚群的流式分析设门策略 本研究以CD45+HLA-DR-CD33+CD11b+细胞群体作为MDSC分析[6]，根据其是否表达CD14和CD15区分M-MDSC和G-MDSC。其中CD14+CD15-MDSC为M-MDSC，CD15+CD14-MDSC为G-MDSC，详细流式分析设门策略见图1。

MDSC：骨髓来源抑制性细胞；G-MDSC：粒细胞性骨髓来源抑制性细胞；M-MDSC：单核细胞性骨髓来源抑制性细胞。

2.2 MDSC亚群在初诊DLBCL患者外周血分布情况 初诊DLBCL患者和健康供者外周血M-MDSC 及G-MDSC的亚群比例分布情况见图2A。多色流式结果表明：与健康供者比较，初诊DLBCL患者外周血中M-MDSC较高，差别有统计学意义(P=0.001，图2B)；初诊DLBCL患者外周血中G-MDSC比例与健康供者比较，差别无统计学意义(P=0.770，图2C)。

DLBCL:弥漫大B细胞淋巴瘤；MDSC：骨髓来源抑制性细胞；G-MDSC：粒细胞性骨髓来源抑制性细胞；M-MDSC：单核细胞性骨髓来源抑制性细胞。A：初诊DLBCL患者和健康供者外周血M-MDSC和G-MDSC的亚群比例分布情况；B：初诊DLBCL患者和健康供者外周血M-MDSC比例(与健康供者M-MDSC比较，△：P<0.05)；C：初诊DLBCL患者和健康供者外周血G-MDSC比例。

2.3 MDSC亚群在初诊DLBCL患者骨髓中分布情况 初诊DLBCL患者和健康供者骨髓中M-MDSC 及G-MDSC的亚群比例分布情况见图3A。初诊DLBCL患者骨髓M-MDSC比例高于健康供者，差别有统计学意义(P=0.001，图3B)；初诊DLBCL组患者骨髓G-MDSC比例与健康供者比较，差别无统计学意义(P=0.213，图3C)。

DLBCL:弥漫大B细胞淋巴瘤；MDSC：骨髓来源抑制性细胞；G-MDSC：粒细胞性骨髓来源抑制性细胞；M-MDSC：单核细胞性骨髓来源抑制性细胞。A：初诊DLBCL患者和健康供者骨髓M-MDSC和G-MDSC的亚群分布情况；B：初诊DLBCL患者和健康供者骨髓M-MDSC比例(与健康供者M-MDSC比较，△：P<0.05)；C：初诊DLBCL患者和健康供者骨髓G-MDSC比例。

2.4 初诊DLBCL患者外周血M-MDSC和G-MDSC 的ROS表达水平 DCFH-DA探针法检测结果可见：初诊DLBCL患者外周血M-MDSC的ROS表达水平与健康供者比较，差别无统计学意义(P=0.098，图4A～B)；初诊DLBCL患者外周血G-MDSC的ROS表达水平高于健康供者，差别有统计学意义(P=0.001，图4C～D)。

3 讨 论

MDSC是一类高度异质性的骨髓来源性细胞，一直是炎症免疫研究的热点[5]。健康人外周血中MDSC数量极少，在炎症或感染等病理状态尤其是肿瘤发生时，骨髓腔受异常信号持续刺激，髓细胞分化能力大大降低，MDSC大量扩增并通过外周血循环聚集于肿瘤和外周淋巴器官，通过抑制T细胞激活、促进巨噬细胞促肿瘤生长表型极化等作用影响机体免疫功能[9-10]。根据表面标记可将MDSC分为M-MDSC和G-MDSC，不同亚群MDSC免疫抑制机制有所不同[4]。研究表明，MDSC与非小细胞肺癌、乳腺癌等肿瘤的发生、发展密切相关[11-15]。LIAO 等[16]在小鼠模型中通过抑制CXCR2、上调CXCL3表达等节点调控可募集MDSC，进而削弱肿瘤杀伤性T细胞免疫功能。

本研究在MDSC流式细胞染色方法中简化了外周血和骨髓中的MDSC及其亚群的检测步骤，无需进行外周血单个核细胞梯度分离这一繁琐操作，可作为MDSC临床检验方法学中的一种参考方法。经检测发现，M-MDSC在初诊DLBCL患者外周血和骨髓中的比例呈一致性增加，但G-MDSC与健康供者相比差别无统计学意义，提示DLBCL患者机体免疫功能受损可能与M-MDSC异常扩增及聚集关联。本研究后续将动态监测DLBCL患者从初次化疗至完全缓解整个阶段的外周血和骨髓中M-MDSC 水平，充分探讨M-MDSC分布是否可作为DLBCL疗效监测的一项指标。

ROS具有调控细胞信号传导和体内平衡等多种主要代谢途径的重要作用[4]。本研究中，与健康供者比较，M-MDSC的ROS表达水平差别并无统计学意义。有意思的是，虽然G-MDSC的数量在初诊DLBCL患者与健康供者中差别并无统计学意义，但ROS作为G-MDSC的主要功能，在初诊DLBCL 患者外周血中呈现较高的表达水平，提示除了M-MDSC在DLBCL患者体内异常扩增之外，G-MDSC 出现功能异常也可能是影响DLBCL患者机体免疫功能异常及疾病发生、发展的另一因素，G-MDSC 主要通过调控ROS表达使免疫细胞处于无应答或耐受状态[9]。同时，DLBCL患者体内G-MDSC 功能可能受到多种因素影响，如M-MDSC与G-MDSC是否会互相作用调控，而其他类型的免疫细胞如巨噬细胞、调节性T细胞等是否会影响G-MDSC 功能等。另一方面，异常表达的ROS对G-MDSC自身数量并无影响，这种自我保护状态也是笔者感兴趣的一个研究方向。若减少G-MDSC或抑制其ROS表达，可有效减轻其对DLBCL患者的机体损伤。笔者拟在后续研究中增加骨髓标本数量，充分探讨G-MDSC功能异常对DLBCL患者骨髓微环境的影响。

本研究尚存一些不足之处，如检测细胞比例和功能测定的方法过于单一、骨髓标本数量较少等；另外，应结合临床资料从机制上对MDSC两大亚群进行进一步分析。

综上所述，初诊DLBCL患者外周血和骨髓中M-MDSC异常聚集，表达水平显著升高；G-MDSC虽然在数量上无显著变化，但其主要功能ROS表达显著高于健康供者。检测MDSC亚群分布情况有利于进一步了解DLBCL患者免疫微环境异常的可能原因，随着研究深入，有望成为监测DLBCL疗效的一项指标。