基于TLR4-MyD88依赖通路白喉乌头单体I抑制树突状细胞成熟的作用机制

王怡杨，贾贝田，曹 敏，刘海朝，金昱彤，韩 露，罗 莉，丛 珊，边育红

(1. 天津中医药大学中西医结合学院，天津 301617；2. 新疆医科大学第一附属医院，新疆 乌鲁木齐 830000)

树突状细胞是体内功能最强大的抗原提呈细胞，能够激活初始T细胞，激活初次免疫应答，在许多疾病如肿瘤、炎症、免疫系统疾病的发生发展中发挥极为重要的作用[1-3]。近年来，中药对树突状细胞免疫功能影响的研究报道日益增多，并且中药日渐凸显其独特的优势[4]。白喉乌头多见于新疆伊犁及阿勒泰地区，具有祛风散寒、止痛消肿、通经活络的功效。前期实验研究表明，白喉乌头原料药、加工产品和单体成分可以下调树突状细胞表面CD80、CD86的表达，影响树突状细胞的成熟，且与TLR4有关[5]。白喉乌头单体I(Delvestidine)是从白喉乌头中分离出的单体化合物[6]，其抑制树突状细胞成熟的机制尚不明确，因此，本研究采用Delvestidine干预脂多糖(LPS)诱导成熟的树突状细胞，检测细胞表面共刺激分子、细胞分泌的促炎和抑炎因子以及TLR4-MyD88依赖通路中关键基因和蛋白表达情况，进一步评价白喉乌头的药效，为相关药物研发提供理论依据。

1 实验材料与方法

1.1实验动物 雄性BALB/c小鼠12只，体重18～20 g，购于北京维通利华实验动物有限公司，动物生产许可证号：SCXK(京)2016-0006。实验动物正常饲养，不予任何刺激。实验经动物伦理审查通过(TCM-LAEC2019093)。

1.2药物与试剂 Delvestidine由宝鸡市辰光生物科技有限公司提取。RPMI-1640培养基、PBS、红细胞裂解液(Hyclone)、胎牛血清FBS(BI)、0.05%胰蛋白酶TE(Gibco)、重组小鼠白细胞介素-4(Murine IL-4)、GM-CSF(PeproTech)购于天津贝尔格莱科技有限公司。FITC标记的CD80、抗体、PE标记的CD86抗体(Biolegend)购于天津贝尔格莱科技有限公司；兔β-actin单克隆抗体(Proteintech)、兔TLR4单克隆抗体、兔MyD88单克隆抗体、兔IKK2单克隆抗体、兔IRAK4单克隆抗体(Cell Signaling Technology)、兔TRAF6单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG二抗(Abcam)购于天津鑫泽宝信科技有限公司。预先包被的小鼠白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-10(IL-10)ELISA检测试剂盒购于杭州联科生物科技有限公司；总RNA提取试剂盒、cDNA第一链合成试剂盒、PCR荧光定量试剂盒购于天根生化科技(北京)有限公司。

1.3仪器 Heracell 150i型CO2培养箱、Herasafe KS型超净工作台、Varioskan Flash型酶标仪(ThermoFisher 赛默飞世尔)；FA2204型电子分析天平(FANGRUI公司)；easyCyteTM型流式细胞分析仪(Guava公司)；MiFly-6型八联排离心机(Abson公司)；K5500型超微量紫外分光光度仪(K.O.公司)；JJQ5型荧光定量PCR仪、164-5050型电泳仪、165-8001型垂直电泳槽、170-3930型小型转印槽(Bio-Rad 伯乐)；UVP Chem Studio型多功能成像仪(德国耶拿分析仪器股份公司)。

1.4实验方法

1.4.1小鼠骨髓来源树突状细胞(BMDCs)的提取和诱导 脱颈处死BALB/c小鼠，75%酒精浸泡10min，无菌超净工作台中剥离出股骨和胫骨。用1 mL注射器和4 mL RPMI-1640培养基反复吹扫骨腔4～5次，冲洗骨髓液。用5 mL注射器抽出3 mL Ficoll-Paque移至15 mL离心管中，取4 mL骨髓液培养基小心地铺在Ficoll-Paque溶液上。分层时，请勿将Ficoll-Paque培养基溶液和骨髓液混合。18～20 ℃下400×g离心30～40 min(关闭制动器)。将中间白色浑浊单核细胞层转移至无菌的15 mL离心管中，离心管中加入3～6 mL PBS溶液。18～20 ℃下400～500×g离心5 min，除去上清液。PBS清洗细胞，离心，条件同上。去除上清液，5 mL的10%完全培养基(10% RPMI-1640+90% FBS)重悬，接种于培养瓶中，37 ℃下5%CO2培养箱中培养4 h后，更换培养基。缓慢弃去上清液，加入含100 ng/mL IL-4和GM-CSF的10%完全培养基，并在第3天和第5天分别半量换液，第7天收集BMDCs，计数。

1.4.2BMDCs表面标记CD80、CD86表达情况及Delvestidine最适浓度筛选 将得到的BMDCs分为5组：正常组细胞采用10%完全培养基培养， LPS组细胞用含200 ng/mL LPS的10%完全培养基培养，LPS+Delvestidine 20 μg/mL组细胞用含200 ng/mL LPS和20 μg/mL Delvestidine的10%完全培养基培养， LPS+Delvestidine 40 μg/mL组用含200 ng/mL LPS和40 μg/mL Delvestidine的10%完全培养基培养，LPS+Delvestidine 80 μg/mL组用含200 ng/mL LPS和80 μg/mL Delvestidine的10%完全培养基培养。各组培养48 h后，收集细胞，分别用FITC标记的抗CD80和PE标记的抗CD86抗体按照说明书进行染色，流式细胞技术检测细胞表面分子CD80和CD86表达情况。

1.4.3BMDCs上清液中IL-6、IL-10含量检测 实验设立正常组、LPS组、LPS+Delvestidine 80 μg/mL组，将BMDCs按2×105的密度接种于6孔板中，置于5%CO2、37 ℃培养箱培养48 h后，收集各组细胞上清液，根据ELISA试剂盒说明书检测IL-6、IL-10含量。

1.4.4BMDCs中TLR4、MyD88、IRAK4、TRAF6 和Ikk2 mRNA表达检测 采用qRT-PCR法检测：细胞分组及处理同1.4.3，收集各组细胞，根据天根RNA simple Total RNA Kit说明书提取总RNA；超微量紫外分光光度计于260 nm和280 nm波长下测定OD值，计算OD260/280，在1.8～2.2范围内被认为是提取的总RNA纯度较高，可以用于后续实验；根据天根FastQuant cDNA第一链合成试剂盒说明书将提取的总RNA反转为cDNA，检测每个样品中的cDNA浓度；根据荧光定量预混试剂(SYBR Green)说明书配置20 μL反应体系：2×SuperReal PreMix Plus 10 μL，上下游引物各0.6 μL，cDNA模板1 μL，RNase-free ddH2O 7.8 μL，斡旋离心混匀，并设置如下反应体系：预变性95 ℃ 15 min；PCR反应95 ℃ 10 s，56 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，反应重复40个循环。以β-actin为内参，采用2-ΔΔct法分析基因相对表达量。引物序列见表1。

表1 TLR4-MyD88依赖通路关键因子qPCR荧光定量引物序列

1.4.5BMDCs中TLR4、MyD88、IRAK4、TRAF6和Ikk2蛋白表达检测 采用Western blot法检测：细胞分组同1.4.3,将BMDCs按1×106的密度接种于T25瓶中，每组3个重复，5%CO2、37 ℃培养箱培养48 h后，收集各组细胞，使用RIPA裂解液冰上提取蛋白，BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度，采用4%～12% SurePAGE预制胶电泳转膜，将PVDF膜用5%脱脂奶粉封闭2 h(TLR4用5%FBS封闭2 h)，1×TBST洗膜6次，5 min/次，用TLR4、MyD88、IRAK4、TRAF6 和Ikk2的一抗孵育(TRAF6 稀释浓度1∶5 000，其余1∶1 000)，4 ℃过夜。洗膜，二抗(1∶4 000)室温摇床孵育2 h，洗膜，曝光。用Image J软件处理分析图像，以目的蛋白灰度值/内参蛋白灰度值表示目的蛋白在各样本的相对含量。

2 结 果

2.1各组BMDCs表面标记CD80、CD86表达情况正常组、LPS组CD80+CD86+细胞比例分别为5.16%和10.41%，LPS组明显高于正常组(P<0.05)；LPS+Delvestidine 20 μg/mL组、LPS+Delvestidine 40 μg/mL组、LPS+Delvestidine 80 μg/mL组CD80+CD86+细胞比例分别为8.32%，7.54%，9.49%，均明显低于LPS组(P均<0.05)，且LPS+Delvestidine 80 μg/mL组明显低于LPS+Delvestidine 20 μg/mL组和LPS+Delvestidine 40 μg/mL组(P均<0.05)，故选择Delvestidine 80 μg/mL进行后续实验。各组流式细胞术检测BMDCs表面标记CD80、CD86表达情况见图1。

图1 正常组和LPS诱导各组BMDCs表面标记CD80、CD86表达情况

2.2各组BMDCs中IL-6和IL-10含量比较 与正常组比较，LPS组IL-6含量明显升高(P<0.05)，IL-10含量明显降低(P<0.05)；与LPS组比较，LPS+Delvestidine 80 μg/mL组IL-6含量明显降低(P<0.05)，IL-10含量明显升高(P<0.05)。见图2。

图2 正常组和LPS诱导各组BMDCs中IL-6和IL-10含量

2.3各组BMDCs中 TLR4、MyD88、IRAK4、TRAF6 和Ikk2 mRNA表达情况 LPS组TLR4、MyD88、IRAK4、TRAF6 和Ikk2 mRNA相对表达量均明显高于正常组(P均<0.05)，LPS+Delvestidine 80 μg/mL组均明显低于LPS组(P均<0.05)。见图3。

图3 正常组和LPS诱导各组BMDCs中TLR4-MyD88依赖通路关键因子mRNA表达情况

2.4各组BMDCs中TLR4、MyD88、IRAK4、TRAF6和Ikk2蛋白表达情况 LPS组TLR4、MyD88、IRAK4、TRAF6和Ikk2蛋白相对表达量均明显高于正常组(P均<0.05)，LPS+Delvestidine 80 μg/mL组均明显低于LPS组(P均<0.05)。见图4。

图4 正常组和LPS诱导各组BMDCs中TLR4-MyD88依赖通路关键因子蛋白表达情况

3 讨 论

乌头始载于《神农本草经》：“味辛，温。主治中风，恶风洗洗，除寒湿痹，咳逆上气，破积聚，寒热。”[7]白喉乌头以根部入药，其味辛、苦、热、有毒，为西北少数民族常用民间草药之一[8]。 王伟等[9]报道白喉乌头中含有氢溴酸高乌甲素、乌头碱、新乌头碱三种生物碱类成分,其中生物碱氢溴酸高乌甲素的量相对较高，在我国作为非成瘾性镇痛药生产。汪芳等[6]利用Sephadex LH-20、硅胶等色谱技术分离出白喉乌头的单体化学成分,根据理化性质和波谱数据进行结构鉴定，共鉴定出5个单体化合物,分别为Delvestidine、高乌甲素、N-去乙酰高乌甲素、氨茴酰牛扁碱、冉乌碱。其中Delvestidine是首次从白喉乌头中分离得到，为白色粉末，碘化铋钾反应呈阳性，分子量600，其化学式为：C33H48N2O8。白喉乌头的主要活性成分为二萜生物碱、脂肪酸等，具有镇痛、抗炎、抗肿瘤等作用[10]。Yang等[5]研究证明白喉乌头可通过抑制滑膜细胞增殖及诱导其凋亡，抑制血管的增生，下调TLR4基因与蛋白水平，抑制炎性因子IL-1β、IL-6和TNF-α的释放，延缓关节炎病变的持续发展。但目前对白喉乌头的研究并不完善，如何高效利用白喉乌头的药用价值成为研究白喉乌头的重要原因。

活化的树突状细胞是体内唯一能够激活初始T细胞的抗原提呈细胞。研究表明，免疫系统疾病发生时有大量成熟树突状细胞聚集[11]，成熟的树突状细胞不仅分泌大量细胞因子，而且在其细胞表面表达高水平的共刺激分子[12]。大量炎性因子是Th细胞的始动者，引发一系列免疫反应[13]。因此，抑制树突状细胞的成熟、减少炎性因子的释放、促进抑炎因子的产生是治疗免疫系统疾病的重要方法。为了确定Delvestidine是否可以改变树突状细胞的功能，本实验采用LPS诱导树突状细胞成熟的细胞模型进行了研究，结果显示LPS能够促进细胞表面CD80、CD86的表达和细胞分泌促炎因子IL-6，抑制抗炎因子IL-10的产生；Delvestidine处理后，细胞表面的CD80、CD86表达和细胞分泌IL-6减少，细胞分泌IL-10增加，说明Delvestidine能够抑制树突状细胞的成熟及活化。

Toll 样受体(TLRs)是一类模式识别受体，在人类及哺乳动物中已经发现11个TLRs家族成员。TLRs是树突状细胞的核心模式识别受体，通过TLRs介导的树突状细胞活化是启动CD4+和CD8+T细胞反应的重要步骤。TLR4是最早鉴定的人类TLRs，可识别微生物产物以及中药多糖等多种外源性物质。药物多糖成分可与细胞表面TLRs结合，通过MyD88依赖/非依赖的信号转导通路活化免疫细胞介导免疫应答。其中MyD88依赖的信号转导通路主要诱导树突状细胞分泌TNF-α等促炎性细胞因子。TLR4激活后，与MD2、CD14两个分子形成 MD2/TLR4/CD14 复合体，使 MyD88 聚集到MD2/TLR4/CD14复合体上，MyD88再通过与IL-1受体相关激酶(IRAKs)相互作用，招募IRAKs至 MD2/TLR4/CD14复合体上，其中IRAK1被IRAK4磷酸化而活化，超磷酸化的IRAK1与TRAF6结合并使其活化，激活下游通路进而导致NF-κB抑制剂激酶2(IKK-2)的激活，致使IκB的磷酸化。一旦磷酸化，IκB就被一种多聚体泛素连接酶泛素化，被蛋白酶体降解，NF-κB异源二聚体p65/p50的核定位序列暴露，这时p65/p50发生核移位，连接到一系列启动子的同源DNA序列上，并募集诱导基因表达所需要的转录零件，调控TNF-α、IL-1β、IL-6等炎症因子的转录水平。这些炎症因子表达水平的增加能进一步刺激NF-κB活化的水平，导致最初炎症信号的进一步放大，进而完成树突状细胞成熟与活化[14-15]。为了进一步阐明Delvestidine在抑制树突状细胞成熟过程中的分子机制，本实验检测了TLR4-MyD88依赖通路中TLR4、MyD88、IRAK4、TRAF6、Ikk2的表达情况。结果表明，LPS组TLR4、MyD88、IRAK4、TRAF6、Ikk2 mRNA和蛋白表达量均较正常组明显升高，LPS+Delvestidine 80 μg/mL组TLR4、MyD88、IRAK4、TRAF6、Ikk2 mRNA和蛋白表达量均明显降低。提示Delvestidine可抑制树突状细胞中TLR4-MyD88依赖通路关键因子的表达，从而抑制细胞分泌促炎因子。

综上所述，Delvestidine可以通过抑制TLR4-MyD88依赖通路关键因子的表达，进而抑制树突状细胞的成熟及活化，发挥抑制免疫应答的作用。提示Delvestidine作为具有抗炎、抑制免疫应答的药物具有潜在的研究价值，为白喉乌头的药物开发及临床应用提供了实验数据，为后续研究奠定了一定基础。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。