治伤风颗粒对发热大鼠模型退热作用的研究Δ

储小毛，王新汝，李泽庚，童佳兵#

(1.安徽中医药大学研究生院，合肥 230012； 2.安徽省中医药科学院中医呼吸病防治研究所，合肥 230012； 3.安徽中医药大学第一附属医院呼吸科，合肥 230012)

治伤风颗粒由葛根汤化裁而成，由葛根、麻黄、桂枝、白芍、大枣、对乙酰氨基酚和无水咖啡因等中西药合成，具有良好的退热作用[1]。本实验旨在明确治伤风颗粒的退热效果，并探讨其退热机制。

1 材料

1.1 实验动物

SPF级雄性SD大鼠40只，购于杭州医学院，生产许可证号为scxk(皖)2019-0002，体重为(200±20)g。大鼠于安徽中医药大学实验动物中心饲养实验。伦理审查批件号：AHUCM-rats-2021029。

1.2 仪器

RT-6000型酶标仪(雷杜生命科学股份有限公司)；JS-1070P型自动曝光仪(上海培清科技有限公司)；JW3021HR型离心机(安徽嘉文仪器装备有限公司)；GL-88B型漩涡混合器(其林贝尔仪器制造有限公司)；DNP-9052BS-Ⅲ型电热恒温箱(上海三发科学仪器有限公司)；ZT-12M型生物组织自动脱水机、YB-7LF型生物组织包埋机、YT-7FB型生物组织摊烤片机(亚光医用电子技术有限公司)；RM2016型徕卡切片机(德国Leica公司)；电子体重秤(中科生命科技股份有限公司)；灌胃针(北京宝元兴业科技有限公司)；电子数字体温计[欧姆龙(中国)有限公司]。

1.3 药品与试剂

治伤风颗粒(明通化学制药股份有限公司第二厂，国药准字ZC20171003，批号：19089009)；布洛芬片(天方药业有限公司，国药准字H37022628，批号：200509063)；安琪高活性干酵母(安琪酵母股份有限公司)；大鼠白细胞介素1β(IL-1β)酶联免疫分析试剂盒(货号：JYM0419Ra)、大鼠白细胞介素6(IL-6)酶联免疫分析试剂盒(货号：JYM0646Ra)、大鼠前列腺素E2(PGE2)酶联免疫分析试剂盒(货号：JYM0446Ra)、大鼠肿瘤坏死因子α(TNF-α)酶联免疫分析试剂盒(货号：JYM0635Ra)、大鼠去甲肾上腺素(NE，货号：JYM0587Ra)、大鼠促肾上腺皮质激素释放激素(CRH，货号：JYM0425Ra)、大鼠α-黑素细胞刺激素(α-MSH，货号：JYM1025Ra)、大鼠精氨酸加压素(AVP，货号：JYM0888Ra)和大鼠环磷酸腺苷(cAMP，货号：JYM0574Ra)均购于武汉基因美科技有限公司；3%戊巴比妥钠溶液；0.9%氯化钠溶液。

2 方法

2.1 动物分组及给药

将SPF级SD大鼠40只随机分为正常组、模型组(等体积的0.9%氯化钠溶液)、布洛芬组(72 mg/kg)和治伤风颗粒组(2.16 g/kg)，每组10只。

2.2 实验方法

适应性喂养大鼠3 d，用电子体温计持续3 d、每日2次测量大鼠肛温，使其适应测温操作。然后采取预防式干预措施，四组大鼠连续以10 mL/kg的体积灌胃给药3 d，1日1次。禁食不禁水6 h后测肛温3次取均值为基础体温，灌胃0.5 h后造模：除正常组大鼠皮下注射等体积0.9%氯化钠溶液外，其余各组大鼠以10 mL/kg剂量皮下注射20%的干酵母混悬液(由0.9%氯化钠溶液配制而成)。间隔1 h测肛温并记录。在造模后5 h再次灌胃给药，第8 h测肛温后采集标本。

于最后1次测肛温后，取3%戊巴比妥钠溶液，按0.1 mL/kg腹腔注射麻醉大鼠，并于腹主动脉取血，置于37 ℃环境下静置。随后迅速取出全脑，置于冰袋上，冰浴下取大鼠下丘脑，以0.9%氯化钠溶液清洗并用滤纸吸湿后，分别放入标本管拧紧擦干后置于液氮罐及10%甲醛固定液中。1 h后以3 500 r/min离心(离心半径10 cm)血液10 min后分离收集上清液，并将液氮罐中的标本管转移至-80 ℃冰箱中贮藏备用。采用酶联免疫吸附试验及生化检测血清及下丘脑中内生致热源IL-1β、IL-6和TNF-α含量，中枢发热介质PGE2含量，下丘脑中CRH、NE和α-MSH含量。采用苏木精-伊红(HE)染色观察下丘脑形态学变化。

2.3 统计学方法

3 结果

3.1 各组大鼠体温比较

相比于正常组，模型组大鼠的体温在造模后6、7及8 h显著升高，差异均有统计学意义(P<0.01)，表明造模成功；相比于模型组，布洛芬组及治伤风颗粒组大鼠的体温在造模后7、8 h明显降低，差异均有统计学意义(P<0.01)，表明治伤风颗粒具有显著的解热作用，见表1。

表1 干酵母致大鼠发热实验中各组大鼠体温结果比较Tab 1 Comparison of body temperature of rats in different groups in the experiment of dry yeast-induced

3.2 大鼠下丘脑组织学形态学

与正常组比较，模型组大鼠下丘脑神经元核固缩，胞质呈现较深伊红色，细胞外间隙增大，可见炎症细胞浸润及小胶质细胞聚集；与模型组比较，布洛芬组及治伤风颗粒组大鼠神经元核固缩程度浅，胞质呈现与正常组相似的伊红色，细胞外间隙较小，仅少量的炎症细胞浸润，见图1。

A.正常组；B.模型组；C.布洛芬组；D.治伤风颗粒组A. normal group; b. model group; c. ibuprofen group; D. Zhishangfeng granules group图1 各组大鼠下丘脑组织切片(HE，×200)Fig 1 Histological sections of hypothalamus of rats in each group (HE, ×200)

3.3 各组大鼠血清及下丘脑IL-1β、IL-6、TNF-α及PGE2水平比较

相比于正常组，模型组大鼠血清和下丘脑中致热性细胞因子IL-1β、IL-6、PGE2及TNF-α水平明显上调，差异均有统计学意义(P<0.01)；与模型组比较，布洛芬治伤风颗粒组大鼠血清和下丘脑中IL-1β、IL-6、PGE2及TNF-α水平明显降低，差异均有统计学意义(P<0.01)，见表2。

表2 各组大鼠血清和下丘脑IL-1β、IL-6、PGE2和TNF-α水平比较Tab 2 Comparison of levels of IL-1β, IL-6, PGE2 and TNF-α in serum and hypothalamus of rats in each group n=6，pg/mL)

3.4 各组大鼠血清及下丘脑AVP、cAMP水平比较

与正常组比较，模型组大鼠血清及下丘脑AVP水平显著降低，cAMP水平显著升高，差异均有统计学意义(P<0.01)；与模型组比较，布洛芬组及治伤风颗粒组血清及下丘脑AVP水平显著升高，cAMP水平显著降低，差异均有统计学意义(P<0.01)，见表3。

表3 各组大鼠血清和下丘脑AVP、cAMP水平比较Tab 3 Comparison of levels of AVP and cAMP in serum and hypothalamus of rats in each group n=6，pg/mL)

3.5 各组大鼠下丘脑CRH、NE及α-MSH水平比较

与正常组比较，模型组大鼠下丘脑中CRH水平明显升高，NE及α-MSH水平明显降低，差异均有统计学意义(P<0.01)；与模型组比较，布洛芬组及治伤风颗粒组大鼠下丘脑中的NE、α-MSH水平明显升高，CRH水平明显降低，差异均有统计学意义(P<0.01)，见表4。

表4 各组大鼠下丘脑CRH、NE及α-MSH水平比较Tab 4 Comparison of levels of CRH, NE and α-MSH in the hypothalamus of rats in each group n=6，pg/mL)

4 讨论

《伤寒论》曰：“太阳病，项背强几几，无汗，恶风，葛根汤主之。” 葛根汤为太阳病之代表方，主要用于邪客太阳经输，经气不利，卫闭营郁的证治。治伤风颗粒以葛根汤加乙酰氨基酚、无水咖啡因、盐酸那可汀和马来酸氯苯那敏制备而成，可用于鼻塞、咳嗽、咽喉痛和发热等上呼吸道感染症状的治疗[2-3]。

发热由发热激活物作用于机体释放内生致热原，进一步作用于体温调节中枢下丘脑释放发热介质，使体温失衡[4-6]。因此，研究内生致热原、中枢发热介质是揭示发热机制和药物解热机制的重要途径[7]。由巨噬细胞等激活释放的IL-1β既可直接引起发热，也可作为内生致热源使体温调定点上移诱导发热[8-9]。有研究结果表明，TNF-α可以刺激PGE2或IL-6生成进而促进环氧合酶的合成，发挥致热作用，也可以与IL-1β协同致热[10-12]。IL-6是促使发热最重要的外周致热源之一，可由中枢及外周的IL-1β介导激发，可触发环氧合酶2的合成，继而通过前列腺素途径介导发热过程。目前已经证实内生致热源IL-1β、TNF-α和IL-6可直接或间接引起重要的中枢发热介质PGE2的释放，进而升高体温[13]。本研究结果显示，治伤风颗粒能通过下调下丘脑和血清中IL-1β、TNF-α、IL-6及PGE2含量显著抑制干酵母致热模型大鼠的体温。

AVP是下丘脑合成和分泌的中枢性解热神经肽类激素，可在腹中隔与中杏仁核起到解热效果[14-15]。cAMP是下丘脑中接近体温调节终末环节的发热介质，其含量与发热程度呈正相关[16]。CRH是存在于下丘脑组织中具有致热作用的神经内分泌激素，其可引起α-MSH等的释放，发挥解热作用[17]。中枢单胺类神经递质NE是温度敏感性神经元的神经化学基础之一，可以引起体温下降[18]。α-MSH是由腺垂体分泌的、具有解热作用的多肽类激素，有研究结果表明，α-MSH可通过阻断IL-1β来发挥解热作用[19-20]。本研究结果显示，治伤风颗粒能显著抑制酵母引起的大鼠体温升高，治伤风颗粒组大鼠血清及下丘脑中cAMP、下丘脑中CRH含量明显低于模型组，血清及下丘脑中AVP以及下丘脑中NE、α-MSH含量明显高于模型组。表明治伤风颗粒能抑制下丘脑CRH的释放，促进NE及α-MSH的释放，发挥解热作用。

综上所述，治伤风颗粒对酵母致热模型大鼠有良好的解热作用，其解热作用与下调下丘脑和血清中IL-1β、IL-6、TNF-α、PGE2和cAMP表达，下丘脑中的CRH表达，上调下丘脑和血清中AVP以及下丘脑中的NE和α-MSH表达有关。