Box-Behnken Design响应面法优化银杏叶总黄酮柱层析纯化工艺

毕艳艳，马庆文，许辉，刘健，龙瑞，唐伟铭，郭田甜，郝大伟*

(1.鲁南厚普制药有限公司，山东 临沂 276006；2.鲁南制药集团股份有限公司 中药制药共性技术国家重点实验室，山东 临沂 276006；3.鲁南制药集团股份有限公司，山东 临沂 276006)

银杏叶系银杏科植物银杏的干燥叶，临床上具有活血化瘀、通络止痛、敛肺平喘、化浊降脂之功效，常用于治疗瘀血阻络、胸痹心痛、中风偏瘫、肺虚咳喘、高脂血症等诸多疾病[1-3]。银杏叶提取物系银杏叶药材中所提取有效部位，其主要化学成分为总黄酮类和萜内酯类化合物，总黄酮苷主要是槲皮素、山柰素、异鼠李素和儿茶素类，萜类内酯主要包括半萜类白果内酯、二萜类银杏内酯 A、B、C、J 和 M[4-7]。国内外临床需求显示，银杏叶提取物各类制剂必将成为临床上治疗心脑血管疾病、痴呆症及抗衰老的重要药物，因此开发银杏叶提取物及各类制剂具有广阔的市场前景和巨大的经济价值。例如2020年康缘药业所申报的银杏内酯滴丸、银杏二萜内酯，目前已作为1类创新药被国家药品监督管理局受理，必然为临床疾病的治疗提供新的手段。

2020版《中国药典》一部收载了银杏叶提取物的制备和质量标准分析测定方法。按照药典要求采用稀乙醇溶液提取回流，粗提物中有较多的杂质，银杏叶总黄酮的质量分数偏低，远远达不到药典要求，需要进一步地分离和纯化。药典规定采用大孔树脂进行纯化，大孔树脂具有价格低廉、易回收再生、易工艺放大，且毒性小等诸多的优点[8-10]。本实验是在单因素试验的基础上，利用BBD(Box-Behnken Design)响应面法优化银杏叶提取物制备过程中大孔树脂柱层析纯化工艺，优化得到的工艺能大大提高银杏叶提取物中银杏叶总黄酮质量分数及收率，降低工艺成本，且工艺路线合理可行，更适合于大生产。

1 材料与仪器

1.1 实验仪器

e2695型高效液相色谱仪(美国Waters公司)；R-300型旋转蒸发器(瑞士BUCHI公司)；Alpha 2-4 LSCbasic型冷冻干燥机(德国Christ公司)；XS204型电子分析天平(Mettler Toledo)；200 mL恒流反应器泵+蛋白压缩柱(上海赛梵科分离技术有限公司)。

1.2 实验材料与试剂

大孔树脂 LX-158(西安蓝晓新料股份有限公司，批号20201029005)；槲皮素对照品(中国食品药品检定研究院，批号100081-201610纯度99.10%)；乙醇(费县大成酒业有限公司，批号210608，食品级；纯度95%)；银杏叶粗提物溶液(中药制药共性技术国家重点实验室)；高效液相色谱仪用试剂均为色谱纯；分析用试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 银杏叶总黄酮质量分数测定方法

2.1.1 色谱条件

2.1.2 对照品溶液的制备

精密称取槲皮素对照品适量，置于50 mL容量瓶中，加适量甲醇超声溶解，放冷后加甲醇配置成0.722 6 mg/mL槲皮素对照品储备液。精密吸取对照品储备液1 mL 置于25 mL容量瓶中，加甲醇稀释定容至刻度，摇匀，即得。

2.1.3 供试品溶液的制备

2.1.4 银杏叶总黄酮质量分数测定

分别精密吸取槲皮素对照品溶液和供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，测定。以槲皮素对照品峰面积为对照，按照2020版《中国药典》上校正因子计算槲皮素、山奈酚和异鼠李素的质量分数。槲皮素、山奈酚和异鼠李素的校正因子分别为1.000 0、1.002 0、1.089 0，相对保留时间分别为1.00、1.64、1.83。总黄酮质量分数按照公式(1)计算，对照品、供试品的HPLC色谱图见图1。

w(总黄酮)=[w(槲皮素)+w(山奈酚)+w(异鼠李素)]×2.51。

(1)

图1 对照品、供试品的HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of the reference and test samples

2.2 大孔树脂的筛选

2.2.1 静态吸附实验

采用静态吸附法考察4种型号大孔树脂对银杏叶总黄酮的吸附和解吸效果。选取经过预处理 D101、LX-5、AB-8、LX-158这4种大孔树脂，抽滤，各称取10 g，分别置于150 mL锥形瓶中。分别加入质量浓度为3 mg/mL银杏叶粗提物溶液50 mL，室温震荡吸附24 h，使大孔树脂吸附饱和，过滤，取出大孔树脂备用，取滤液测定总黄酮质量分数[11-12]。

2.2.2 静态洗脱实验

将过滤后的大孔树脂置于150 mL锥形瓶内，用蒸馏水冲洗除杂，并吸干表面水分，加入70%乙醇50 mL，室温震荡洗脱24 h后，过滤，取滤液测定总黄酮质量分数[11-12]。计算不同类型大孔树脂的吸附率与解吸率。结果见图2。由图2可知，与其他类型大孔树脂相比，LX-158对于银杏叶总黄酮的吸附率和解吸率较高，因此，选用LX-158进行实验。

图2 不同类型大孔树脂对银杏叶总黄酮的吸附率与解吸率Fig.2 The adsorption and desorption rates of different types of macroporous resins for total flavonoids extracted from Ginkgo biloba

2.3 单因素试验

采用单因素分析法，分别考察上样浓度、洗脱剂乙醇体积分数、洗脱液接收体积和洗脱流速对银杏叶总黄酮柱层析效果的影响。分别设置上样质量浓度为2、3、4、5 mg/mL，乙醇体积分数为50%、60%、70%、80%，洗脱液接收体积为1、2、3、4 BV，洗脱流速为1、2、3、4 BV/h，其他变量按照洗脱剂乙醇体积分数为70%，洗脱流速为2 BV/h，洗脱液接收体积为2 BV，上样质量浓度为3 mg/mL进行实验。

由图3可知，随着上样质量浓度的增大，银杏叶总黄酮质量分数和收率先增加后降低；随着乙醇体积分数的增大，总黄酮质量分数先增加后降低，而收率一直增加；随着接收体积的增加，总黄酮质量分数先增加后降低，收率一直增加，随着洗脱流速的增加，总黄酮质量分数及收率先增加后降低。因此分别选择上样质量浓度2、3、4 mg/mL，乙醇体积分数60%、70%、80%，接收体积为1、2、3 BV，洗脱流速为1、2、3 BV/h进行后续响应面法优化实验，考察对柱层析效果的影响。

图3 不同因素对银杏叶总黄酮柱层析效果的影响Fig.3 The effect of different factors on the column chromatographic purification of total flavonoids from Ginkgo biloba

图3(续)

2.4 响应面工艺优化分析

BBD响应面法是一种优化多变量系统的实验设计方法，可通过多元二次回归方程拟合多个因素与多个响应值之间的函数关系，通过回归方程数学模型寻求最佳条件和参数，从而获得较为精确的最佳工艺参数和响应目标的最优值[13]。近年来，该方法已经被广泛应用于中药及复方有效成分的提取纯化工艺的优化中。

2.4.1 评价指标

在单因素试验的基础上，根据BBD响应面法设计原理，以银杏叶总黄酮质量分数(R1)、收率(R2)及二者综合评分(R综)为响应值，以上样质量浓度(A)、洗脱剂乙醇体积分数(B)、洗脱液接收体积(C)及洗脱流速(D)为考察因素，其变化水平如2.3节所述，考察对银杏叶总黄酮柱层析纯化工艺的影响。因为总黄酮质量分数和收率具有相关性，总黄酮质量分数增大会导致其收率的降低，反之亦然。在保证银杏叶总黄酮质量分数的前提下，为了尽可能提高其收率，所以选择银杏叶总黄酮质量分数(R1)、收率(R2)权重系数分别为60%、40%，R综计算如式(2)所示。

R综=(R1/R1max×60%+R2/R2max×40%)×100。

(2)

2.4.2 实验结果

BBD响应面优化柱层析工艺设计方案及结果见OSID科学数据与内容附表，二次回归方程方差分析如表1所示。

表1 BBD响应面优化柱层析工艺二次回归方程方差分析

表1(续)

利用Design-Expert V8.0.6软件对表1中的数据进行二次多元回归拟合，R综对各因素的二次多项回归模型方程为R综=-687.44+60.03A+18.12B+30.43C+24.12D-0.11AB-0.16AC+0.56AD+0.13BC+0.035BD-1.39CD-8.47A2-0.13B2-9.05C2-6.49D2，R2=0.992 6。

回归拟合结果分析可知，对银杏叶总黄酮质量分数R1，收率R2来说，回归模型P<0.01，说明回归模型极显著，模型成立；失拟项P>0.05，说明失拟项影响差异无统计学意义，提示回归方程拟合度良好。本实验以R综为综合评价指标，对于R综来说，回归模型P<0.01，说明回归模型极显著，模型成立；A、B、A2、B2、C2、D2因素P<0.01，交互项AB、BC、CD的P<0.05，差异具有统计学意义。

2.4.3 响应面模型分析

利用Design-Expert V8.0.6软件得到二次回归方程的响应面图，以此评价实验各因素之间的交互强度，以确定最佳纯化工艺参数。交互项AB、BC、CD等高线图与3D响应面图见图4。

图4 各因素交互作用对综合评分R综的影响Fig.4 The influence of the interaction of various factors on the comprehensive score Rcomprehensive

图4(续)

等高线越接近椭圆形或响应面线越陡峭说明这两种交互因素对响应值影响越显著，反之不显著。由图4(a)可知，综合评分R综随着上样质量浓度与乙醇体积分数的增加而逐渐增大，当到达最大值后逐渐减小。由等高线形状可知，上样质量浓度与乙醇体积分数两因素交互作用较强，对R综影响较显著，且上样质量浓度对R综的影响大于乙醇体积分数对R综的影响。由图4(b)可知，综合评分R综随着接收体积与乙醇体积分数的增加而逐渐增大，当达到最大值后逐渐减小。由等高线的形状可知，接收体积与乙醇体积分数两因素交互作用较强，对R综影响较显著，且乙醇体积分数对R综的影响大于接收体积对R综的影响。由图4(c)可知，综合评分R综随着洗脱流速与接收体积的增加而逐渐增大，当达到最大值后逐渐减小。由等高线的形状可知，洗脱流速与接收体积两因素交互作用较强，对R综影响较显著,且洗脱流速对R综的影响大于接收体积对R综的影响。

由响应面实验得到，各因素对R综值的影响从大到小排序为：上样质量浓度，洗脱剂乙醇体积分数，洗脱流速，洗脱液接收体积。且交互项上样质量浓度与洗脱剂乙醇体积分数，洗脱剂乙醇体积分数与洗脱液接收体积，洗脱剂接收体积与洗脱流速对R综值影响显著。

利用Design-Expert v8.0.6软件优化得到最佳柱层析纯化工艺：上样质量浓度为3.13 mg/mL，洗脱剂乙醇体积分数为71.06%，洗脱液接收体积2.08 BV及洗脱流速为2 BV/h。

2.5 验证实验

结合实际所需，最终确定柱层析纯化工艺：上样质量浓度为3.1 mg/mL，洗脱剂乙醇体积分数为71%，洗脱液接收体积2 BV及洗脱流速为2 BV/h。按照上述柱层析纯化工艺，完成3批验证实验。实验结果为银杏叶提取物中总黄酮的平均质量分数可达到35.77%，收率为93.30%，RSD(相对标准偏差)分别为1.21%、2.30%；R综平均值为98.45，预测值为98.62，R综实测值与预测值基本一致；且银杏总内酯质量分数达到《中国药典》标准，证明验证实验具有可行性。

3 结论

本实验在单因素试验基础上，利用BBD响应面法进行多组实验的设计优化，实现对多个因素多个水平的综合考察，得到最佳的工艺条件[14-15]。最佳柱层析纯化工艺为上样质量浓度为3.1 mg/mL，洗脱剂乙醇体积分数71%，洗脱液接收体积2 BV及洗脱流速为2 BV/h 。经验证，银杏叶提取物中总黄酮的平均质量分数可达到35.77%，收率为93.30%，R综平均值为98.45。本研究优化得到的最佳柱层析纯化工艺能尽可能地减少杂质，大大提高银杏叶总黄酮质量分数，且银杏叶总黄酮、总内酯的质量分数均达到《中国药典》的标准，为大生产制成各种制剂提供原料药作参考。