顶空气相色谱法测定醋酸卡泊芬净中残留溶剂

王秀龙郭朝江刘志钰朱兵峰张贵民

(1.鲁南制药集团股份有限公司,山东 临沂 276000;2.鲁南新时代生物技术有限公司,山东 费县 273400)

醋酸卡泊芬净是一种棘白菌素类抗真菌药物,通过非竞争性抑制(1,3)-β-D葡聚糖的合成,引起细胞壁结构破坏,最终致使菌体死亡[1]。在临床上可用于治疗念珠菌感染和念珠菌血症,以及对其他治疗无效或不能耐受的侵袭性曲霉菌病[2-3],醋酸卡泊芬净对耐氟康唑和两性霉素B的念珠菌属均具有体外抗菌活性[4-5]。

在生产醋酸卡泊芬净原料药过程中可能会用到甲醇、乙醇、异丙醇、乙腈、二氯甲烷、四氢呋喃和乙酸乙酯等有机溶剂,根据《中国药典》2020年版四部通则0861残留溶剂测定法的规定,这7种有机溶剂的残留量均有一定的限度。有文献[6-7]报道二类溶剂甲醇、乙腈、二氯甲烷和四氢呋喃,三类溶剂乙醇、异丙醇和乙酸乙酯等溶剂的气相测定方法,其中二氯甲烷由于限度低,常采用ECD检测器检测;在普通毛细管柱上,溶剂异丙醇、乙腈和丙酮等峰常在同一位置出峰,对检测造成干扰。笔者采用Inert Cap 624毛细管色谱柱,研发了顶空分析方法，并使用该法对醋酸卡泊芬净原料药中可能残留的7种溶剂进行研究,通过准确定量以更好地控制残留溶剂,保证产品质量可靠及人体用药安全。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂

Nexis GC-2030气相色谱仪、HS-20顶空进样器,岛津公司;XS105DR型电子天平,梅特勒-托利多仪器有限公司。

醋酸卡泊芬净,鲁南新时代生物技术有限公司,批号200201;甲醇、乙醇和乙腈,德国默克有限公司,色谱纯;异丙醇,上海星可高纯溶剂有限公司,色谱纯;二氯甲烷,西格玛奥德里奇有限公司,色谱纯;乙酸乙酯和二甲基亚砜,德国默克有限公司,色谱纯;四氢呋喃,南京化学试剂股份有限公司,分析纯。

1.2 实验方法

1.2.1 色谱条件

采取程序升温,初始温度40 ℃,维持5 min,以20 ℃/min的升温速率升至100 ℃,维持2 min;以80 ℃/min的升温速率升至180 ℃,维持2 min;进样口温度为200 ℃;检测器温度为250 ℃;顶空瓶平衡温度为80 ℃,平衡时间为30 min;载气为高纯氮气,进样量为1 mL。

1.2.2 对照品标准液配制

精密称定甲醇、乙醇、异丙醇、乙腈、二氯甲烷、乙酸乙酯和四氢呋喃,置于10 mL容量瓶中,用二甲基亚砜溶解并稀释,制成每1 mL中约含甲醇150 mg、乙醇250 mg、异丙醇250 mg、乙腈20.5 mg、二氯甲烷30 mg、乙酸乙酯250 mg、四氢呋喃36 mg的混合溶液,作为对照品标准液。

1.2.3 线性标准液配制

精密量取1.2.2节对照品标准液1 mL,置于50 mL容量瓶中,用二甲基亚砜稀释至容量瓶刻度,摇匀,作为线性标准液。

1.2.4 待测样品溶液配制

精密称定醋酸卡泊芬净200 mg,置于20 mL顶空瓶中,加入二甲基亚砜2 mL使之溶解,密封,作为待测样品溶液。

2 结果与分析

2.1 专 属 性

2.1.1 空白溶剂

精密量取二甲基亚砜2 mL,置于20 mL顶空瓶中,密封,作为空白溶剂,按气相色谱法测定。色谱图如图1所示。由图1可知:空白溶剂色谱图中7种残留溶剂对应的位置无干扰峰检出,故不会干扰对本品中7种残留溶剂的检查。

图1 空白溶剂色谱图

2.1.2 残留溶剂峰定位

精密量取1.2.2节对照品标准液1 mL,置于50 mL容量瓶中,用二甲基亚砜稀释至容量瓶刻度,摇匀,作为残留溶剂峰定位溶液。精密量取该溶液2 mL,置于20 mL顶空瓶中,密封,按气相色谱法进行测定,色谱图如图2所示。由图2可知:7种溶剂的峰形良好,各色谱峰之间的分离度均不小于1.5。

1—甲醇;2—乙醇;3—异丙醇;4—乙腈;5—二氯甲烷; 6—乙酸乙酯;7—四氢呋喃。

2.2 系统适用性实验

精密量取1.2.2节对照品标准液1 mL,置于50 mL容量瓶中,用二甲基亚砜稀释至容量瓶刻度,摇匀,作为系统适用性溶液。精密量取该溶液2 mL,置于20 mL顶空瓶中,密封,按气相色谱法进行测定,结果见表1,其中理论板数、对称因子和分离度的数据均来源于谱图。由表1可知:7种溶剂色谱峰之间的分离度均大于1.5,峰面积的相对标准偏差RSD均小于1%,系统适用性良好。

表1 系统适用性实验结果

2.3 检测限与定量限

各取适量甲醇、乙醇、异丙醇、乙腈、二氯甲烷、乙酸乙酯和四氢呋喃,分别置于7个50 mL容量瓶中,分别加二甲基亚砜稀释至容量瓶刻度。采用逐级稀释法,取信噪比的10倍值和3倍值[8],按气相色谱法进行测定,结果见表2。由表2可知:7种溶剂的检测限为0.041～0.654 μg,定量限为0.182～1.744 μg。

表2 检测限与定量限实验结果

2.4 线性与范围实验

精密量取1.2.3节线性标准液0.5,1,2,4,5 mL,分别置于10 mL容量瓶中,用二甲基亚砜稀释至容量瓶刻度,摇匀,作为线性浓度溶液。精密量取该溶液2 mL,置于20 mL顶空瓶中,密封,配制6份,按气相色谱法进行测定。以峰面积y对浓度x建立线性回归方程,结果见表3。由表3可知7种溶剂的线性关系均良好。

表3 线性与范围实验结果

2.5 精密度实验

考察重复性和中间精密度:1) 精密量取2.2节系统适用性溶液2 mL,置于20 mL顶空瓶中,密封,配制6份,按气相色谱法测定重复性并分别计算各色谱图中7种溶剂峰的峰面积的RSD,结果见表4。2) 第1天分析员A分别精密量取2.2节系统适用性溶液2 mL,置于20 mL顶空瓶中,密封,配制6份,按气相色谱法测定中间精密度。3) 第2天分析员B精密量取同一系统适用性溶液2 mL,置于20 mL顶空瓶中,密封,配制6份,按气相色谱法测定中间精密度,分别计算各色谱图中7种溶剂峰的峰面积的RSD,结果见表4。由表4可知:7种溶剂的重复性和中间精密度均良好。

表4 精密度实验结果

2.6 回收率实验

精密量取二甲基亚砜2 mL,置于20 mL顶空瓶中,作为空白溶液。分别精密量取1.2.2节对照品标准液0.8,1,1.2 mL,置于3个50 mL容量瓶中,加二甲基亚砜稀释至容量瓶刻度,摇匀,作为回收率实验溶液。分别精密量取2 mL实验溶液,置于20 mL顶空瓶中,每个回收率实验溶液各配制3份,密封,作为80%,100%和120%的供试品溶液。以100%的溶液作为对照品溶液,按气相色谱法测定。按外标法分别计算7个溶剂的测得量并计算每个回收率的RSD,结果见表5。由表5可知笔者方法对7种溶剂均具有良好的回收率。

表5 回收率实验结果

2.7 耐用性实验

分别改变进样口温度±20 ℃、载气流量±20%、顶空加热平衡时间±5 min,采用同种方法进行测定。结果表明:测定结果没有明显差异,峰形和分离度均符合要求,表明笔者方法的耐用性良好。

2.8 样品测定

精密量取系统适用性实验项下的对照品溶液2 mL,置于20 mL顶空瓶中,密封,配制2份,按气相色谱法测定。取本品约200 mg,精密称定,置于20 mL顶空瓶中,加入二甲基亚砜2 mL,完全溶解后密封,配制2份,按气相色谱法进行测定。按外标法分别计算7种溶剂的质量分数[9-10],每个样品测定2次并取平均值,结果见表6。由表6可知:笔者方法能准确地测定醋酸卡泊芬净中的7种残留溶剂,使其符合产品质量标准以及药品生产质量管理规范的要求[11]。

表6 样品测定结果

2.9 讨 论

2.9.1 色谱条件的选择

笔者先后考察了Inert Cap WAX(30 m×0.32 mm×0.50 μm)柱和Inert Cap 624(30 m×0.32 mm×1.80 μm)柱,对比分析后笔者采用Inert Cap 624毛细管色谱柱。溶剂均不干扰各主成分峰的测定,7种残留溶剂峰的保留时间均小于8 min,且各个溶剂峰之间的分离度良好。测试方案:起始温度为40 ℃,保持5 min;以20 ℃/min升至100 ℃,保持2 min;以80 ℃/min升至180 ℃,保持2 min。笔者方案可满足各主成分峰的测定要求。

2.9.2 顶空平衡温度及时间的选择

根据供试品中残留溶剂的沸点选择顶空平衡温度,结果表明:当平衡温度为80 ℃,平衡时间为30 min时,各主成分峰的峰面积达到最大值。因此,选择平衡温度为80 ℃,平衡时间为30 min。

2.9.3 溶剂的选择

以水、二甲基亚砜和N,N-二甲基甲酰胺作为溶剂进行考察,其中水与乙酸乙酯不互溶,N,N-二甲基甲酰胺溶解后的干扰峰较多,二甲基亚砜效果较好,因此确定以二甲基亚砜作为溶剂。

2.9.4 方法的确定

参考其他厂家和文献[12]报道,醋酸卡泊芬净原料药中控制了甲醇、乙醇、乙腈、乙酸乙酯和四氢呋喃等5种溶剂,笔者结合所在厂家的工艺,增加了对二类溶剂二氯甲烷及三类溶剂异丙醇的控制,采用该法控制醋酸卡泊芬净原料药中的7种残留溶剂,使笔者厂家的产品更加安全有效。

3 结 论

方法学验证和样品测定结果表明:笔者建立的顶空气相色谱法测醋酸卡泊芬净原料药中7种残留溶剂的方法,分离度良好,灵敏度高,操作简便,能够对醋酸卡泊芬净原料药中的残留溶剂进行准确定量,可以更好地控制醋酸卡泊芬净原料药的产品质量。