侧孢芽孢杆菌对锌尾矿先锋植物富集Zn、Cd能力的影响

李圆圆，郝 喆，孙 杰

(辽宁大学 环境学院，辽宁 沈阳 110036)

0 引 言

近年来，由于矿产资源逐渐枯竭或矿山政策性关停等原因，形成了大量责任主体缺失的废弃尾矿库。这些废弃尾矿库由于缺乏有效的监管措施与管理制度，生态环境问题十分突出。废弃尾矿砂中的大量重金属在地表径流或雨水淋滤作用下，污染周边土壤[1]。修复受污染土壤的方法主要有稳定化修复、提取法、加热解析法、生物炭改良剂等，这些方法具有成本高、易造成二次污染等缺点，因此不适用于大范围的土壤修复，而植物修复成本低、无二次污染，可用于大范围尾矿库的生态修复。

国内外诸多学者在植物修复重金属污染土壤方面做了一系列研究。李凯俊[2]等对南京铅锌矿区土壤重金属及其主要植物的生物富集作用进行了评估，结果显示14种先锋植物均具有耐金属性，可用于生态修复；Samaneh Torbati[3]等研究了生长在伊朗湿地的3种植物对重金属的生物富集作用，证明植物香蒲能在根部积累大量的Cd、Zn、Pb，根系元素富集系数大于1；刘秉浩等[4]利用外生菌根樟子松对废弃尾矿池进行植物修复，实验表明含外生菌根的樟子松明显富集更多的Zn、Cd、Pd；T Pardo[5]等将赤泥衍生物与堆肥的混合物以及熟石灰混合播撒于田地中，然后将尾矿土壤原封不动地转移并混合到植物生长的田地中，并播种了滨藜和短叶霸王，证明结合使用赤泥衍生物，堆肥和盐生植物是一种良好的植物稳定策略；程刚仁[6]等评估了豆科植物、根瘤菌和丛枝菌根真菌(AMF)在铀污染土壤复垦中的共生关系，结果表明，AMF和根瘤菌在三重共生中具有互利关系，从而显着增加了植物的生物量和铀积累。上述研究均可以证明野外植物在添加菌剂或者其他试剂后，提升了植物富集尾矿库土壤中的重金属Zn、Cd的能力，而不同植物富集重金属的能力也有所不同。此外，有些研究者对微生物菌修复重金属污染土壤也有一定的研究。崔兆杰、张旭[7]等研究证明复合微生物菌剂对重金属的固定化效率高达74.98%(Zn)、85.29%(Pb)和79.41%(Mn)，显示出较好的生物修复效果；Sami Ullah Jan[8]等研究表明金属抗性芽孢杆菌组合提高了欧洲油菜在污染土壤中的重金属富集效率；Edward Raja Chellaiah[9]通过研究发现，生物触媒剂铜绿假单胞菌不仅可以对促进植物生长，还可以提高植物对重金属Cd的吸附能力。

目前，对植物和微生物联合修复土壤重金属污染的研究大多限于盆栽小试阶段，缺乏直接应用于野外尾矿土壤的试验研究，并且对所选富集植物种类的研究较少。文章选用郴州柿竹园废弃锌尾矿库上生长的小蓬草(Conyzacanadensis(Linn.)Cronq)、肾蕨(Nephrolepisauriculata(L.)Trimen)、长芒草(StipabungeanaTrin)、小蓼(PolygonimminusHuds)4种先锋植物作为研究对象，进行野外实验，通过向4种植物的根际土壤中加入不同剂量的侧孢芽孢杆菌菌剂，培养期结束后分别测定植物地上部分、地下部分及植物根系周围土壤中的Zn、Cd含量，分析不同菌剂用量对植物吸附重金属Zn、Cd的影响，以期为修复尾矿土中重金属污染工作提供重要理论依据。

1 试验及分析方法

1.1 野外试验布置

试验场地位于湖南省郴州市柿竹园有色金属有限责任公司的废弃锌尾矿库。调研表示：锌尾矿库采样点为pH≤6的酸性土壤，且该尾矿库土壤中重金属Zn2+、Cd2+的变化范围较广，分别为598.05～2 156.45 mg/kg和23.60～42.95 mg/kg。

(1)在矿区采用五点取样法，选择高度、生长年龄相近的肾蕨、长芒草、小蓬草、小蓼4种现场自然生长的植物，每种植物采3株，植物照片如图1所示。为减少伤根在移植前一天浇水润湿根部土壤，用小工具扒开植物根系外围，然后用小铲垂直用力铲下，为避免破坏根系主根完整性，挖掘土壤深度为35 cm。

(2)在尾矿库中央选择一块阳光适宜的空地(4 m×1 m)，挖4个间隔40 cm的长方形沟渠(40 cm×85 cm×40 cm)，将之前移出的植物放入沟渠中，每个沟渠放4种植物，每种植物放3株，竖直排放，从后至前依次为：小蓬草、小蓼、肾蕨、长芒草，每种植物根系间距约为20 cm，用挖出的深层土壤进行填埋。植物布局如图2所示。

(3)选用蘸根、灌根结合的方式，将侧孢芽孢杆菌菌剂用少量清水稀释[10]，把移栽植物的根部浸入到稀释溶液中，使其充分沾上菌液，之后按照剂量对其进行灌根培土。期间每2个月向土壤中均匀加入5、10、20、30 g剂量的侧孢芽孢杆菌菌剂。

图1 4种先锋植物照片Fig.1 Photos of four pioneer plants

图2 植物布局示意图Fig.2 Schematic diagram of plant layout

1.2 试验方法

对土壤用前述方式维护6个月后采集实验区植物地下部位、地上部位和根部土壤样品，进行样品前处理。

(1)植物

植物的清洗：将所挖出的植物用自来水小流量冲洗，保证植物的完整性，并无土壤残留，然后再用蒸馏水淋洗一遍，用吹风筒距离15 cm将植物吹干，不滴水即可，最后将其放在对应编号的密封袋中。

植物的烘干：将清洗后植物放入烘箱中烘至恒重，再将植物根和露出土壤部分分开，分别将其磨碎，倒出后研磨成粉状，放入编号的封装袋中，于干燥器中保存[11]。

植物的消解：分别精确称取0.200 0 g4种植物的地上样品和地下样品放入100 mL的三角瓶中，加入5 mLHNO3、1 mLH2O2摇匀，静置1夜。样品封口后置于微波消解器中，按表2的微波消解条件其消解完全后，将消解好的溶液倒入100 mL的容量瓶中，滴加2%的硝酸进行定容，倒入广口瓶待测。

(2)土壤

土壤的烘干：将土壤分批放入烘箱中，控制温度在60～70 ℃，干燥12 h，放入编号的封装袋中，于干燥器中保存。

土壤的消解：将处理好的土壤样品放入三角瓶中，先用去离子水润湿，再加入5 mLHNO3、1 mLH2O2摇匀，静置1夜。待土壤样品完全消解后，将溶液倒入100 mL的容量瓶，滴加2%的硝酸进行定容，倒入广口瓶中密封保存待测。

表1 微波消解条件

重金属测定：采用原子吸收光谱法分别测定植物粉末和土壤粉末中重金属Zn、Cd含量。

1.3 分析方法

选用富集系数和转移系数来进行分析，二者能最直观地反映出植物富集重金属Zn、Cd的能力。对于一个受污染的生态系统而言，处于不同营养级的生物对污染物的富集能力不同，这两者可以明确反映出不同植物在侧孢芽孢杆菌作用下富集重金属Zn、Cd的影响。

富集系数(Enrichment Factor, EF)是样品中元素的浓度与背景中元素的浓度的比值，以此判断环境介质中元素的污染状况。简言之就是单位质量的生物量富集的污染物含量。由式(1)可计算富集系数EF。

(1)

式(1)中：Ci/Cnsediment是土壤中金属i与标准化元素n的测定含量比，Ci/Cnbackground是土壤中金属i与标准化元素n的背景值含量比。

重金属转移系数是指植物露出土壤部分的重金属含量与土壤地下根际中重金属含量的比，是用来评价植物将重金属从露出土壤部分向地下运输和富集能力的一种指标，用TF表示。TF值越高表明植物露出土壤部分的重金属富集量越大，越适用于植物修复技术。由式(2)可计算转移系数TF。

(2)

式(2)中：S植物地上部分某种重金属元素含量，g/mol；R植物地下部分该种元素的含量，g/mol。

2 结果与讨论

2.1 植物富集系数与菌剂用量的关系

试验考察了菌剂剂量分别为0、5、10、20、30 g时4种先锋植物对重金属Zn、Cd的富集系数，图3为植物富集系数和菌剂用量的关系。

图3 植物富集系数和菌剂用量关系图Fig.3 Relationship between the plant enrichment coefficient and bacterial agent consumption

由图3可知，添加侧孢芽孢杆菌菌剂后，先锋植物小蓬草对土壤重金属Zn的富集系数Zn大于Cd。当菌剂剂量达到20 g时，小蓬草富集土壤中的重金属Zn的能力达到峰值1.8；随着菌剂剂量的增大，添加30 g侧孢芽孢杆菌菌剂时，小蓬草富集重金属Zn的能力下降。

当添加侧孢芽孢杆菌菌剂后，先锋植物长芒草对土壤重金属Cd的富集系数大于Zn。当菌剂剂量达到5 g时，长芒草富集土壤中的重金属Cd能力达到峰值1.3；添加菌剂剂量在5～30 g时，长芒草富集土壤中重金属Cd的能力呈下降趋势；添加菌剂达到30 g时，对长芒草富集重金属Cd的能力基本没有影响。

对比先锋植物肾蕨添加侧孢芽孢杆菌菌剂后对2种重金属的富集系数，可以明显看出菌剂对肾蕨富集重金属Zn的能力影响甚微。随着菌剂添加量的不断加大，肾蕨富集重金属Cd的能力迅速下降，当菌剂添加量达到30 g时，富集系数甚至下降到未添加侧孢芽孢杆菌菌剂时的1/4。

先锋植物小蓼对重金属Zn的富集能力在添加侧孢芽孢杆菌菌剂为10 g时达到峰值。随着菌剂剂量的增大，小蓼的富集系数逐渐趋于未添加菌剂时的富集系数，这表明添加菌剂剂量在20～30 g时，不会提高小蓼对Zn的富集能力；此外，由图3(b)可以看出，添加菌剂后，小蓼吸附重金属Zn、Cd的能力从初始值0.96下降到0.2，但在添加菌剂为20 g时富集系数突然上升接近初始值0.96，证明施加菌剂后，小蓼吸附重金属Zn、Cd的能力没有得到改善，反而下降。

2.2 植物转移系数与菌剂用量关系

试验考察了菌剂剂量分别为0、5、10、20、30 g时4种先锋植物对重金属Zn、Cd的转移系数，图4为植物转移系数和菌剂用量的关系。

由图4(a)可知，添加侧孢芽孢杆菌菌剂后，先锋植物小蓬草对土壤重金属Zn的转移系数大于Cd。随着菌剂剂量逐渐增大，小蓬草转移重金属Zn的能力逐渐上升。当菌剂剂量达到30 g时，小蓬草转移土壤中的重金属Zn的能力达到峰值0.96。

当添加侧孢芽孢杆菌菌剂后，添加剂量低于20 g时，先锋植物长芒草对土壤重金属Cd的转移系数大于Zn。当菌剂剂量达到20 g时，长芒草富集土壤中的重金属Cd能力达到峰值1.04；添加菌剂达到30 g时，长芒草转移重金属Cd的能力下降为0.32。

图4 植物转移系数和菌剂用量关系图Fig.4 Relationship between the plant transfer coefficient and bacterial agent consumption

对比先锋植物肾蕨添加侧孢芽孢杆菌菌剂后对2种重金属的转移系数，可以明显看出肾蕨转移重金属Cd的能力在添加菌剂达到10 g时提升效果最显著。当菌剂添加量达到10 g时，转移系数达到最高的1.5；随着菌剂添加量的提升，达到30 g时，转移系数下降至0.4。

先锋植物小蓼对重金属Zn的转移能力在添加侧孢芽孢杆菌菌剂为10 g时达到峰值。随着菌剂剂量的增大，小蓼的富集系数逐渐趋于未添加菌剂时的富集系数，这表明添加菌剂剂量在20～30 g时，提高小蓼对Zn的转移能力较弱；此外，由图4(b)可以看出，添加菌剂后，小蓼侧孢芽孢杆菌菌剂的存在明显增强了小蓼转移Cd的能力，相较于未添加菌剂的0.11，添加菌剂剂量在5～30 g 时，转移系数达到了原来的4～6倍。

3 结 论

通过加入不同剂量侧孢芽孢杆菌菌剂对柿竹园锌尾矿先锋植物进行野外移植，测定植物地上部分、地下部分及植物根系周围土壤中的Zn、Cd含量，分析不同剂量菌剂作用下植物对Zn、Cd的富集系数和转移系数影响的关系，结论如下：

(1)添加侧孢芽孢杆菌菌剂后，小蓬草对重金属Zn的富集系数大于Cd；长芒草对重金属Cd的富集系数大于Zn，随着剂量的增大，小蓬草和长芒草对重金属Cd的富集系数先增大后减小。

(2)添加侧孢芽孢杆菌菌剂后，肾蕨富集重金属Zn的能力几乎不变，随着菌剂剂量的增大，肾蕨富集重金属Cd的能力下降；小蓼富集重金属Zn的能力添加侧孢芽孢杆菌菌剂为10 g时达到峰值1.61，富集重金属Cd的能力下降。

(3)添加侧孢芽孢杆菌菌剂后，小蓬草对重金属Zn的转移系数大于Cd；添加剂量达到20 g之前，长芒草对重金属Cd的转移系数大于Zn，随着菌剂剂量的增大，长芒草对重金属Cd的转移系数先增大后减小最后趋于稳定。

(4)添加侧孢芽孢杆菌菌剂后，在添加菌剂达到10 g 时，肾蕨转移重金属Cd的能力提升效果显著，而其他4种剂量则影响微弱；添加菌剂后，小蓼转移Cd的能力较未添加菌剂明显增强，转移系数达到了原来的4～6倍。

(5)4种先锋植物除了小蓼之外，其他3种在施加10～20 g侧孢芽孢杆菌菌剂时，对土壤中重金属的富集能力较强。小蓬草、肾蕨、长芒草Zn的转移系数分别为0.96、0.82、0.67，而3种植物Cd的转移系数依次为0.6、1.5、1.04。这4种植物中肾蕨对菌剂剂量最敏感。富集转移重金属Zn、Cd能力排序为：肾蕨>小蓼>长芒草>小蓬草。