天然产物活性分子毛兰素抗肿瘤作用研究进展

洪 静， 杨方瑶， 蒋立翔， 简甜甜， 王思瑜， 黄新河

(西南交通大学 生命科学与工程学院， 成都 610031)

天然产物及其衍生物拥有结构新颖多样、生物活性高等特点，一直以来都是药物研发重要的来源之一[1]。来源于天然产物的生物碱、黄酮类、萜类、皂苷类化合物具有多种药理活性，已被广泛用于治疗多种重大疾病,如恶性肿瘤、心脑血管疾病、感染性疾病等[2]。

兰科石斛属植物种类繁多，是一类药用价值丰富的天然产物，石斛的药用历史距今已有两千多年[3]，可以强健体魄、延年益寿，因此被传统中医列为滋补上品。毛兰素是提取自铁皮石斛及鼓槌石斛中的一类联苄类化合物，近年来发现毛兰素在体内外对多种癌细胞株具有抗肿瘤作用[4]，是一种极具潜力的抗癌活性分子。毛兰素可通过多种机制对不同的肿瘤发挥抑制作用，已有报道发现毛兰素可以抑制癌细胞生长和增殖、诱导癌细胞凋亡或自噬、阻滞癌细胞周期、诱导癌细胞分化、抑制癌症组织新生血管的生成、抑制细胞迁移和侵袭、抑制炎症反应、提高机体免疫力等[5]。

本综述旨在总结和分析抗癌活性物质毛兰素抗肿瘤作用潜在的分子机制，并探讨毛兰素在临床治疗癌症中的应用前景。可对毛兰素的构效关系进行研究，开发以毛兰素作为先导化合物的抗癌新药。

1 石斛的主要活性成分及药理作用

石斛是兰科植物石斛属DendrobiumSw.药用植物新鲜或干燥茎的统称，是我国传统名贵中药材，具有丰富的药用价值，石斛种类繁多，目前有5种石斛被《中国药典》收录,分别是铁皮石斛、金钗石斛、流苏石斛、霍山石斛和鼓槌石斛。现代医学对石斛的化学成分、药理作用以及临床使用进行了大量研究，其活性成分主要为生物碱、多糖、菲类、联苄类、黄酮类、甾醇类、萜类、氨基酸等化合物[6]。药理学研究证明石斛具有抗氧化、抗肿瘤、调节免疫、降血糖、解热镇痛抗炎、心血管与神经保护作用等[7]，其中石斛及其提取物的抗肿瘤活性已被越来越多的学者研究和报道。

2 毛兰素及其他联苄类提取物的抗肿瘤作用

毛兰素(Erianin)，2-methoxy-5-[2-(3,4,5-trimethoxy-phenyl)-ethyl]-phenol(图1)是一种分离提取自鼓槌石斛中的低分子量单体，分子式为C18H22O5，目前在金钗石斛、铁皮石斛、球花石斛、流苏石斛中均发现含有毛兰素。除石斛属外，毛兰素植物E.carinata中也可分离得到毛兰素[8]。除了天然来源，目前毛兰素也可通过化学合成获得。

图1 毛兰素结构式Figure 1 Structure of erianin

传统中医常将毛兰素作为一种解热镇痛药物，目前研究发现毛兰素在体内外均可抑制肿瘤生长，具有优秀的抗肿瘤活性，是一种广谱的抗肿瘤活性成分。目前国内外对毛兰素抗肿瘤机制已有比较全面的研究，结果表明其可通过多种机制发挥抗肿瘤活性，如抑制细胞生长和增殖、促进肿瘤细胞凋亡和自噬、抑制细胞转移、抑制肿瘤新生血管生成、调节免疫等[10]。

毛兰素属于联苄类化合物，而联苄类化合物在石斛属药物中广泛存在。在石斛属药物中除毛兰素外的多种联苄类化合物被报道在体外具有抗肿瘤活性。如从金钗石斛中提取的鼓槌联苄、玫瑰石斛素被发现在体外对高侵袭性肝癌具有抑制作用[9]；从鼓槌石斛中分离提取的石斛酚被发现对骨肉瘤U20S细胞增殖、迁移和侵袭具有抑制作用[10]；从反瓣石斛中提取得到的4,5,4-三羟基-3,3-二甲氧基联苄被发现可以抑制肺癌细胞的迁移[11]。

上述研究均证明石斛属中的联苄类化合物是石斛类药物发挥抗肿瘤作用的重要活性成分，同时说明联苄的分子结构对毛兰素发挥抗肿瘤活性也具有重要作用，这为后续石斛属抗肿瘤活性分子的筛选提供了新思路。

3 毛兰素的抗肿瘤机制

3.1 毛兰素抑制癌细胞生长和增殖

癌细胞的快速增殖是其区别正常细胞的一大特点，快速增殖带来的机体消耗往往使患者虚弱甚至死亡，因此目前临床上的许多化疗药物通过抑制恶性肿瘤的生长增殖来达到治疗目的。

研究表明，小分子化合物毛兰素在体内及体外对一系列人类癌细胞株具有细胞毒性，包括对白血病K562[12]、HL-60细胞[13]、胃癌MGC803、SGC-7901细胞[14-15]、肝癌SMMC-7721、HepG2、Huh7、SNU449、Bel-7402细胞[16-19]、结肠癌SW480、HCT116细胞[20-22]、骨肉瘤MG63.2 细胞[23]、乳腺癌细胞T47D[24]、肺癌A549、LL/2细胞[25-26]、膀胱癌EJ、T24细胞[27-28]、鼻咽癌NPC-BM、NPC-039细胞[29]、宫颈癌Hela细胞[30-31]、口腔鳞状癌SCC9、CAL27、OSC20细胞[32]等(表1)， 毛兰素均表现出显著的抗肿瘤活性，且该抑制作用具有时间和剂量依赖性，毛兰素对癌细胞株的平均IC50值在纳摩尔水平。这些实验数据提示，毛兰素是一种极具潜力的抗癌活性成分，但其药效学和毒理药理学仍有待进一步研究。

3.2 毛兰素诱导肿瘤细胞凋亡

细胞凋亡又称程序性死亡,是由机体内外因素触发细胞内预存的死亡程序而导致细胞死亡的过程[33]。真核细胞主要存在4种凋亡通路，毛兰素被报道主要通过内源性凋亡途径诱导癌细胞发生凋亡。其中，天冬氨酸蛋白水解酶 (caspase) 家族级联反应的激活在内源性凋亡过程中起着执行作用,其激活往往伴随着底物蛋白酶PARP的降解[34]。如白血病HL-60细胞[13]、乳腺癌T47D细胞[24]、结肠癌SW480细胞[20]、口腔鳞状细胞癌OSCC细胞[32]、肝癌 SMMC-7721 和HepG2细胞中[16]均有报道毛兰素可通过引起caspase级联反应和激活PARP的活性，最终启动线粒体介导的内源性凋亡途径，从而诱导上述多种肿瘤细胞凋亡。

类似地，毛兰素可以抑制人骨肉瘤细胞的生长，毛兰素通过激活活性氧依赖的JNK/c-Jun通路诱导caspase级联反应和细胞凋亡[23]。Bcl-2家族蛋白与线粒体凋亡途径密切相关[33]，其主要包括促凋亡蛋白(BAG-3，Bcl-2，Bcl-W，Bcl-X等)和抗凋亡蛋白(Bax、Bak、Bim、Bad、Bid等)，在肝癌SMMC-7721 和HepG2细胞异种移植瘤裸鼠模型中，毛兰素处理上调促凋亡蛋白Bax、Bad、Bim和PUMA的表达，下调Bcl-2的表达，诱导肝癌细胞凋亡，且呈时间剂量依赖性[18]。在膀胱癌EJ和T24细胞中，毛兰素通过上调Bim和下调Bcl-2诱导细胞凋亡，这是通过激活JNK信号通路实现的[27]。

p53是一种抑癌基因，在宫颈癌Hela细胞中，毛兰素促进p53的活化来促进细胞周期阻滞和凋亡，并通过调节ERK1/2信号和线粒体途径引起凋亡[30]；在毛兰素处理后的T47D细胞中，促凋亡因子Bax，p12,p18,p27、p53、p21显著上调[24]。在人鼻咽癌细胞中，毛兰素通过抑制ERK信号通路促进细胞凋亡，且该效应可以被ERK通路激活剂减弱[29]，也有报道发现毛兰素通过抑制PI3K/AKT和p38-ERK MAPK信号通路诱导肝癌细胞凋亡[16]。上述研究表明，毛兰素可以通过多种机制促进癌细胞发生凋亡从而发挥其抗肿瘤作用。

3.3 毛兰素阻滞癌细胞周期

针对癌细胞的周期失调，将其阻滞于某一周期从而抑制其无限增殖是抗肿瘤治疗的一大策略[35]。

体外实验发现，在肝癌HepG2和SMMC-7721细胞[18]及结直肠癌HCT116、SW480细胞中[20]，毛兰素诱导细胞发生G2/ M期阻滞来抑制细胞增殖，同时伴随G0/ G1期和S期细胞数量减少[30]。此外，毛兰素诱导宫颈癌Hela细胞的周期蛋白CyclinD1和ICAM-1的表达下调，将其阻滞于G1期细胞周期。而在口腔鳞癌细胞中，毛兰素处理24 h后，G2/M期细胞显著增加，使其被阻滞于G2/M期而抑制其生长[32]。在人骨肉瘤细胞中，毛兰素可以诱导其G2/M期阻滞，这是通过调控CyclinB1，phospho-Cdk1，phospho-Cdc25c，p21和p27的表达上调，CDK1表达下调来实现的[23]。在乳腺癌T47D细胞中，毛兰素诱导其G2/M期阻滞，且毛兰素处理后周期蛋白依赖性激酶CDK1、2、4、7、8、9、10的转录水平下调[24]。在膀胱癌EJ和T24细胞中，体外实验表明毛兰素通过调控细胞周期相关蛋白的表达来诱导G2/M期周期阻滞[27]。结果表明，毛兰素可以调控多种细胞周期相关蛋白促进细胞周期阻滞，但其具体机制还有待进一步研究。

3.4 毛兰素癌诱导肿瘤自噬

细胞自噬又称Ⅱ型程序性死亡，是细胞内重要的物质分解代谢过程，主要通过双层膜结构的自噬泡包裹错误蛋白或受损细胞器,与溶酶体融合,经溶酶体酸性水解酶水解作用产生能量和小分子供细胞再次利用的过程[36]。

自噬在肿瘤发展中的作用复杂，目前被广泛接受的是自噬在肿瘤的发生发展中具有双重作用[37]。LC3参与了自噬体膜的形成,LC3经过两步加工形成LC3II、LC3II定位于自噬体,是自噬体的形成标志[36]。在口腔鳞癌细胞SAS和SCC9细胞中，毛兰素处理24 h后，可以观察到自噬细胞的特征自噬小体的形成，毛兰素通过上调两种细胞系中LC3-I和LC3-II的表达，降低自噬接头蛋白p62的表达，诱导了细胞自噬[32]。而在骨肉瘤143B和MG63.2细胞中，ROS/JNK通路介导了毛兰素诱导的细胞自噬，毛兰素促进骨肉瘤细胞中酸性囊泡细胞器增多，这也是自噬的特征之一，同时其上调自噬相关蛋白LC3BII、Beclin-1和自噬接头蛋白p62的表达来促进癌细胞自噬。在使用自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)抑制毛兰素诱导的自噬后，细胞凋亡反而增强[23]，说明毛兰素促进的癌细胞自噬对骨肉瘤是一种保护作用。

3.5 毛兰素抑制肿瘤侵袭和转移

恶性肿瘤最大的特性就是侵袭和转移,这也是导致化疗失败及患者死亡的主要原因。上皮间质转化(EMT )是极性和黏附性的上皮细胞特征减少而迁移和侵袭的间充质细胞特性增强的过程，EMT在癌症转移过程中起重要作用[38]。EMT受到如钙黏蛋白(cadherin)、转录因子、基质金属蛋白酶(MMPs)等的调节[39]。

在结肠癌HCT116细胞中，毛兰素通过抑制程序性细胞死亡配体1(PD-L1)来诱导间充质标记物N-cadherin、vimentin和转录因子Slug显著下调，同时上调上皮标记物E-cadherin来抑制癌细胞的转移[20]。MMPs在肿瘤转移和肿瘤血管生成中具有重要作用，可降解细胞外基质而降低细胞的黏附性，增强肿瘤细胞的侵袭和转移。毛兰素通过下调侵袭相关基因vimentin、N-cadherin、slug、snail、MMP-9以及上调侵袭抑制基因E-cadherin来抑制肺癌H460和H1299细胞的转移[40]。毛兰素可以通过调控ERK1/2通路抑制乳腺癌T47D的转移，且具有良好的时间依赖性，毛兰素可以下调MMP2、MMP9、CDH2和纤连蛋白的表达，并上调侵袭抑制基因MMPs组织抑制剂1 (TIMP1)、TIMP2和CDH1的表达[24]。此外，毛兰素通过抑制N-cadherin、MMP-2、MMP-7、MMP-9水平，促进E-cadherin的表达显著升高，来抑制肝癌SMMC7721和HepG2细胞的转移[16]。

3.6 毛兰素抑制肿瘤新生血管生成

毛兰素被报道通过下调PD-L1、VEGF和MMP9的表达水平和抑制人脐静脉内皮HUVEC细胞的小管形成，抑制人宫颈癌Hela细胞中的新生血管生成。此外，在人宫颈癌Hela异种移植瘤裸鼠模型中，毛兰素通过降低HIF-1α、RAS和VEGF的表达，抑制小鼠体内新生血管生成[30]。JAK/STAT通路和吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)与血管生成密切相关，毛兰素被报道可以抑制IDO诱导的脐静脉内皮HUVEC细胞血管生成，而在血管生成模拟实验中，毛兰素可以抑制小鼠肺癌LL/2细胞IDO诱导的血管生成拟态，而且毛兰素可以阻断p-JAK2、p-STAT3的表达，降低MMP-9、MMP-2，这是通过毛兰素对JAK2/STAT3通路的调控实现的，此外，毛兰素还可以抑制小鼠LL/2细胞IDO诱导的COX-2、HIF-1和IL-6的表达水平[26]，说明毛兰素可以通过调控炎症微环境中的关键因子发挥抗肿瘤新生血管生成的效应。研究发现，毛兰素抑制人脐静脉内皮HUVEC细胞的增殖和小管的形成，并抑制其迁移和黏附，而且毛兰素可以破坏内皮细胞的细胞骨架结构，表现出强大的抗血管生成能力;在体内的鸡胚绒毛尿囊膜实验(CAM)中，毛兰素剂量依赖性的抑制bFGF诱导的和自发的血管生成反应[41]。此外，毛兰素的衍生物ZJU-6在CAM实验中也表现出优秀的抗血管生成能力，上述数据均表明，毛兰素在体内外均具有强大的抗血管生成能力[42]。

3.7 其他机制

免疫疗法目前是抗肿瘤治疗一大有力手段。研究发现，在HeLa细胞与活化的T细胞共培养的模型中，毛兰素作用后细胞上清液中细胞因子TNF-α和IFN-γ含量增加，说明毛兰素增强了T细胞对HeLa细胞的细胞毒性，使其发挥杀伤肿瘤细胞的作用[30]。有研究发现在BALB/c裸鼠的HepG2和SMMC -772异种移植瘤模型中，发现毛兰素提高了血清TNF-α和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的功能[18]，说明毛兰素可以提高免疫系统功能。

肿瘤微环境中存在大量的炎症因子和炎症细胞，他们相互促进并有利于慢性炎症的发生和浸润[43]。有研究发现在BALB/c裸鼠的HepG2和SMMC -772异种移植瘤模型中，毛兰素处理后降低了细胞氧化应激反应,提高了抗氧化因子HO-1和SOD-1的基因表达水平，这与毛兰素调控Nrf2和NF-κB通路有关[18]。

4 总结与展望

石斛属药物具有多种药理活性，被广泛应用于医疗保健品行业，在石斛属单体中，毛兰素的抗肿瘤作用被广泛报道，但目前对毛兰素作用直接靶点的鉴定、毛兰素的成药工艺研究、药物不良反应、药理学研究、结构优化等方面仍缺乏深入探索。毛兰素在体内外均可通过多种信号通路及重要分子发挥其抗肿瘤作用[16,18,23-24,30,32,40]，本课题组将其归纳并具体总结如图2。

图2 毛兰素抗肿瘤作用机制Figure 2 Summary of the anti-tumor mechanism of erianin

本文总结了毛兰素可能的抗肿瘤作用机制，旨在为毛兰素后续研究奠定基础。