干血点一种新型反兴奋剂检测技术

甄世乐

（西北师范大学 甘肃 兰州 730000）

体育运动中兴奋剂只是一种统称，泛指世界反兴奋剂机构（WADA）明令运动员或其教练员在运动训练中禁止使用的物质和方法，由每年发布的《禁用清单》划定其违禁范围。而这清单中的一些新型兴奋剂以非常小的剂量使用，称为微剂量，以逃避检测或其中一些物质结构与身体自身合成代谢的物质又极其相似无法准确判断出是否使用了违禁物质，兴奋剂检测难度越来越大。随着新型兴奋剂的不断使用，新型检测兴奋剂的技术也随之迅速发展。液相色谱和质谱连用的检测技术通过与干血点（dried blood spot，DBS）技术的结合能够对大部分禁用清单中的物质进行检测，现已成为兴奋剂检测中配合尿液检测的重要辅助检测方式。

相较于传统的静脉血采集取样干血点（DBS）采样技术只需从足跟，耳朵或手指点刺收集通常为20μl的毛细血管血液体积是微创性的。同时与传统的样品基质均为液体（尿液，血浆，血清）相比干血点（DBS）只需将样品保存在滤纸上具有稳定性和易保存性。这极大地简化了储存和运输条件。因此该技术在兴奋剂检测中受到了越来越多的关注。干血斑（DBS）是一种在滤纸上干燥的全血标本的采样技术，已有接近60年的历史。1963年，Robert Guthrie首次报道了这种使用足跟刺血的微量采样方法的应用，该测定方法引入了一种用于新生儿苯丙酮尿症诊断研究的测定方法。随后的应用中特别是在新生儿代谢紊乱筛查中被广泛应用。在过去的几十年中，通过液相色谱法与质谱相结合的DBS分析已经牢固确立，并且检测物质数量大大增加。广泛用于疾病监测（例如癌症，糖尿病），临床前药物开发，毒理学和药代动力学研究，治疗药物监测（TDM）和代谢组学分析。

这种检测技术应用于兴奋剂检测是极有潜力的，在兴奋剂检测领域受到了很高的重视，各国专家学者也进行了广泛的研究。随着2022年北京冬奥会的圆满举办新型兴奋剂检查检测手段“干血点”也成功完成在奥运会的正式亮相。这是首次将干血点检查检测作为兴奋剂常规检测手段。去年东京奥运会上，干血点技术进行试验性应用，而在北京冬奥会上，干血点检测正式被使用，这项反兴奋剂技术我国也全程参与了研发。本文便从DBS采样技术的优势以及对兴奋剂禁用清单中的物质检测范围方面的研究现状进行分析讨论，为进一步使DBS采样技术应用于我国运动员训练过程中兴奋剂的监测提供依据。

1、干血点（DBS）采样的优势

干血点（DBS）采样是一种新型样本采样技术和样本形态，称为干血点，也被称为干血斑或干血片。它是通过刺穿受试者皮肤毛细血管来收集一小滴指尖或足跟全血于样本采集卡上经室温干燥后形成血斑。再经过溶剂萃取后，通过串联质谱等后端检测设备可对干血斑中待检测物质进行检测分析。因此该技术在运动员兴奋剂采样检测中具备以下优势。

1.1、样本采集对运动员损伤小、便于采集

兴奋剂检测中静脉采血根据世界反兴奋剂组织机构（WADA）的要求，需要对运动员进行静脉采血。静脉采血需要对运动员的皮肤进行穿刺以获取大量的静脉血液来得到进行兴奋剂检测所需要的足量血浆。而干血点（DBS）采样技术只需要从运动员指尖或者上臂利用专业设备来进行微小的穿刺采样，相比于静脉采血其对运动员身体的侵入性较小只是微创对运动员造成的损伤也更小。由于采血量很少大约只有100μL可以直接将指尖或者上臂血液滴到采样卡上来制备运动员的干血点样本。样本采集简单且采血量小所用时间与静脉采血相比也更少，便于运动员兴奋剂检测时的采样工作。同时对采集环境与人员要求相较于静脉采血也比较低，可以在同一时间、地点对运动员进行大量的采样非常的便捷。在世界上众多的宗教信仰与各地的法律法规中存在一些不能进行静脉采血的禁忌情况，而干血点（DBS）采样技术则能够很好地在遵守当地法律法规的同时完成对运动员的血液兴奋剂检测。

1.2、样本的运输与储存方便、经济

在目前兴奋剂检测程序中，对运动员所采集的样本均以液体的形式来进行运输与储存，采集到的全血样本被要求在低温环境下进行储存与运输。而干血点（DBS）则便于保存与运输，样品保存到带干燥剂的密封袋中，可在室温下储存数周至数年，与全血液体保存的方式相比不需要放入冷藏柜中储存时所占用的空间也更小，相同空间中所能储存的样本量更多更方便。根据兴奋剂检测程序规定所采集的样本需要被送到国际奥委会医学委员会授予的具有国际检测资格的兴奋剂检测实验室中进行检测分析，在这运输过程中传统液体样品需要长期的保存在低温环境中。因此，要耗费巨大的资金资源来进行运输与储存。但是DBS样本则在常温环境中就能够轻易地储存与运输并不需要在运输过程中进行制冷处理，这极大地减少了资金的支出相比于传统的样品运输与储存成本更低、更经济。并且能够很好地在偏远地区进行样品的采集工作，与传统的样品收集相比具有很大的优势。

1.3、采集样本中的物质具有更高的稳定性

传统样本基质均是以液体的形式（尿液、血浆、血清）来保存，这些液体样本中的物质只有在低温环境中才能防止产生缓慢的变化，一些物质甚至在低温环境中也能够逐渐分解使其浓度降低，（例如，类固醇脂）这便会影响检测结果的准确性。而且液体样本很容易因为暴露于外界环境之中而产生样本污染的问题。干血点（DBS）样本的基质在室温环境中也能够长时间保存，对于某些禁止物质及其亚类可能会在其他类型的基质中更快的分解为其他物质。如果样品中存在不稳定化合物，则应根据实际情况储存在（2-8℃或－60℃）环境中也能够长期稳定的保存。DBS的基质性质以及分析物的吸附作用使得 DBS中的分析物有较低的反应性。DBS样本稳定性的提高可能是由于酶促降解过程失活而优于血浆，样品中存留的水分是化合物发生酶解或水解的关键因素。因此，DBS样本相较于传统样本中保存的分析物质更具有稳定性。

2、干血点（DBS）采样技术对兴奋剂禁用清单中物质的检测

世界反兴奋剂机构（WADA）每年都会发布禁用物质与禁用方法的《禁用清单》，其中明确规定了在体育运动中禁止使用的物质种类与方法。根据物质在人体中的不同作用机制，可以分为10类禁用物质、3种禁用方法和1类特殊项目禁用物质。在这些禁用物质当中有很多必须通过不同的代谢物、降解产物或生物标记物等进行监测以判断是否使用了这些违禁药物。这些清单中物质的分解代谢大多是随尿液的排出而被释放出体外，但是也有一些物质不能通过尿液检测出来比如血液类的兴奋剂，这些物质只有通过对运动员进行血检才能被发现。因此干血点（DBS）采样技术既弥补了静脉血检对运动员产生的损伤于复杂的采集程序又可以很好地作为尿检的一种补充。干血点（DBS）采样技术在对禁用清单中的物质检测方面已进行了许多的研究，并且在这方面我国也全程参与了研发，在2022年北京冬奥会上也首次使用DBS采样技术对运动员进行了兴奋剂检测。本文从2022年我国最新发布的《兴奋剂目录》中种类最多的蛋白同化制剂、肽类激素、刺激剂这几个方面对干血点（DBS）采样技术在禁用清单中物质的检测进行阐述。

2.1、蛋白同化制剂的检测

蛋白同化制剂又称同化激素是合成代谢类药物也就是我们俗称的合成类固醇，具有促进蛋白质的合成与分解的特征，能够促进肌肉生长，提高身体力量增强男性特征。根据世界反兴奋剂机构公布的数据显示，在运动员被检测出兴奋剂的使用中合成类固醇使用的比例最高，这也导致了合成类固醇的准确检测成为了兴奋剂研究人员一直以来关注的重点。合成代谢类固醇睾酮自1976年以来被国际奥林匹克委员会（IOC）禁止，但仍然是最常检测到的兴奋剂之一。睾酮是一种类固醇激素，在人体由胆固醇合成，它能够调节许多生理过程，包括肌肉蛋白质代谢，红细胞生成和改变血浆脂质水平等。运动员摄入后能诱导瘦体重和肌肉力量的增加，以及疲劳恢复时间的缩短。由于睾酮人体自身也能够产生，普通尿液检测无法确定其是否为运动员自身的内源性睾酮还是违规摄入的外源性睾酮。Forsdahl Guro等人通过使用液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)对6名受试者进行了睾酮脂的临床研究，研究结果表明在给药后的血液样品中，所有被调查的睾酮酯都能被检测到。LauraTretzel等人通过使用高效液相色谱（HPLC）耦合高分辨率串联质谱（HR-MS/MS）对DBS样本中的8种合成代谢类固醇酯（苯丙酸诺龙，庚酸曲恩龙，醋酸睾酮，环己酸睾酮，异己酸睾酮，苯基丙酸睾酮，癸酸睾酮和十一酸睾酮）和诺德龙进行了检测。结果表明，通过液相色谱高分辨率/高精度质谱法能够精确的这些物质并能够明确的证明外源性睾酮及其衍生物的结合物的施用。Jing Jing等人基于确定运动员滥用合成类固醇脂的目的，开发验证了一种全自动的在线DBS制备与检测方法，用于通过DBSA-TLX-HRMS系统对13种合成代谢类固醇酯进行筛选和定量分析。结果发现该系统能够对合成类固醇脂进行符合WADA标准的有效检测，证明了自动化DBS分析在掺杂控制中检测合成代谢类固醇酯的适用性。干血点（DBS）技术与液相质谱检测技术结合在运动员是否使用了蛋白同化制剂类的兴奋剂监测中具有很大的发挥潜力。杨声等人建立了液相色谱-高分辨离子轨道阱质谱法从干血点中提取并检测睾酮酯类兴奋剂的新方法，解决了辨别外源性睾酮的难题，已通过ISO-17025质量体系认证，作为一种睾酮类兴奋剂药物的有效检测手段，在北京2022年冬奥会、冬残奥会的反兴奋剂检测中进行了应用。

2.2、肽类激素的检测

从1989年国际奥委会将肽类激素定为新一类兴奋剂以来 ,对这类物质的检测研究便一直是反兴奋剂研究中重点关注的热点药物。这类物质具有外源性药物（肽类兴奋剂）与内源性激素（人体自然产生）区别小，在人体内药物代谢时间短的特点，曾长期无法被准确可靠的检测而被运动员广泛滥用。Tobias Lange等人通过近红外光谱从干血斑（DBS）中进行机器人辅助非破坏性血细胞比容测量，然后通过LC-HRMS检测全自动样品制备，包括强阳离子交换固相萃取和蒸发，从而能够检测出46种低分子质量（＜2 kDa）肽、非肽药物和候选药物。Gemma Reverter-Branchat等人开发了一种分析程序，用于从DBS中提取GHRP-2及其主要代谢物（AA-3），并通过液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）检测它们。该方法经过他们的验证，可用于检测GHRP-2。特异性和识别能力的评估也符合WADA规定的兴奋剂指南中的要求。并且检测GHRP-2的限值确定到了50pg/ml，证实了长期稳定性能够达到两年以上。他们的研究提供了具体证据，支持DBS在检测GHRP-2以及潜在的其他GHRP家族成员进行兴奋剂检测方面的有效性。胰岛素样生长因子-1（IGF-1）是生长激素作用的主要介质，并被用作检测rhGH滥用的生物标志物。干血斑（DBS）中GH生物标志物的测量将大大简化样品收集和运输方法。基于以上原因Holly D.Cox等人开发并验证了一种通过液相色谱串联质谱法定量测量DBS中完整IGF-1蛋白的方法。该方法被证明具有良好的特异性，精度和准确性可以应用于反兴奋剂领域和rhGH滥用检测。

2.3、刺激剂的检测

这是一类最早被运动员使用，也是最早被禁止的一类兴奋剂，也是最原始意义上的兴奋剂，作用效果速度快，能够对神经肌肉起到直接的兴奋刺激作用。Asami Kojima等人研究描述了液相色谱串联质谱法运用干血点检测与定量实验的尿液进行比较来检测黄麻碱和甲基黄麻碱。结果表明，麻黄碱和甲基麻黄碱的尿液排泄会受到尿液pH值或尿量的强烈影响。这表明，尿液浓度不能反映运动员循环系统中麻黄碱的精神活性水平。因此，干血分析能适用于在竞争测试期间充分检测兴奋剂。Fathiah A Zubaidi等人使用了一种基于MRM-EPI-MRM多周期-多实验的液相色谱串联质谱技术对干血点（DBS）中苯丙胺类兴奋剂相关的药物进行了检测。研究中分析的ATS相关药物包括麻黄碱，伪麻黄碱，安非他明，甲基苯丙胺，MDMA（3，4- 亚甲二氧基甲基苯丙胺），MDA（3，4- 亚甲二氧基苯丙胺），MDEA（3，4-亚甲二氧基-N-乙基苯丙胺）和芬特明。结果表明，该方法能够快速而简单的确认苯丙胺类兴奋剂的使用，且具有更高水平的可信度。

3、DBS对我国运动员在训练中进行兴奋剂监测的应用前景

干血点（DBS）技术在2022年北京冬奥会上被首次作为一种兴奋剂的检测方式应用于对参赛运动员使用违禁物品的检测，这项技术我国全程进行了参与和相关设备的研发,2019年开始与国际奥委会、世界反兴奋剂机构、国际检查机构、美国反兴奋剂中心等共同进行研发等工作。2021年5月，中国反兴奋剂中心（北京实验室）顺利通过干血点扩项检测认可。我国成为世界上率先开展干血点检查的国家之一。根据世界反兴奋剂机构规定的《监察调查国际标准》中的规定，干血点样本采集器材需要独立的制造商且还需满足ISO/IEC 17025认可的实验室检测，中国反兴奋剂中心便和浙江大学、国药集团与浙江奥泰等单位合作研制了干血点样本采集器材，并在北京冬奥会和冬残奥会上运用干血点采样技术对运动员全面实施常规检查。我国已经为使用干血点(DBS)技术在运动员兴奋剂检查领域的推广应用做好了准备。

干血点（DBS）技术具有采样量少、微创和运输及储存成本低的特点，不受样本采集、检测的时间和地点所限制。这便为运动员兴奋剂的检测提供了一种便捷且容易监测的方法。在训练过程中可以经常、不定期的对运动员进行采血为运动员个人提供更多的检测数据，对运动员进行一个时时监测。随着干血点（DBS）在2022年北京冬奥会上的成功应用，通过该技术对我国运动员在训练、备战过程中提供了有力支持，能够避免违规使用兴奋剂的现象，保障了训练、比赛、日常生活和伤病治疗中误服误用兴奋剂事件的发生从而造成的兴奋剂检测阳性的结果。

4、结束语

干血点虽然在2022年北京冬奥会中进行了首次亮相但其在兴奋剂检测中的应用以初具锋芒，凭借着其与传统血液基质相比微量、微创、易保存的特点，可以成为尿检的很好补充。随着实验室对样本的自动化检测程度的不断提高，DBS采样技术可以提高检测的效率和有效性，推动兴奋剂的检测向自动化发展。虽然通过DBS采样技术与液相色谱串联质谱技术现已能够检测出许多违禁物质但还需要开发更加灵敏的检测技术进一步提高对违禁物质检测的灵敏性和扩大检测范围，对未来建立运动员兴奋剂生物护照奠定基础。为反兴奋剂技术的发展，提升捍卫纯洁体育的能力做出重大贡献。随着DBS技术的成熟，对于我国运动员在训练过程中的兴奋剂监测工作也做好了充分的准备，希望这种新型采样技术能够在我国反兴奋剂领域得到更加广泛的应用，从我国自身做起维护体育运动的公平与公正。