纤维素降解细菌的分离筛选及鉴定

刘佳莉 舒菲

(河北环境工程学院生态学系，河北 秦皇岛 066102)

绪论

我国目前还是一个重要的农业发展大国，作物的播种规模居全球第一[1]。长期以来，秸秆作为一种农业废弃物以焚烧的形式处理，浪费资源，破坏环境，危害人畜健康，目前，东北三省地区已经成为我国秸秆焚烧问题最为严重的地区[2]。国家也出台了许多有关秸秆禁焚的政策，禁止秸秆焚烧主要依靠政府出台的相关政策及监管力度，这在一定程度上降低了焚烧秸秆的频率，秸秆不焚烧，势必造成大量秸秆堆积，而解决秸秆堆积这一难点的关键之处在于如何加强秸秆的综合利用[3]。采取何种恰当的技术路线和方案，用科学的技术手段将农业废弃物资源化，是当前我国农业生产需要解决的问题之一[4]。

我国对于农作物秸秆资源的综合利用方式以秸秆肥料化、秸秆饲料化为主，其次是秸秆的燃料化利用，除此之外还有秸秆基料化与原料化利用，其中秸秆肥料化的利用量占秸秆总量的47.3%[5]，对秸秆进行堆肥处理，添加腐熟剂，腐熟完成后形成有机肥再还田，可有效解决秸秆直接还田所引发的问题。

在自然界中存在大量产纤维素酶的细菌菌株，经过对产纤维素酶细菌的分离、筛选和驯化，一般对人类和动物无害，还可以进一步提高纤维素资源再利用的效率[6]。本研究筛选具有解纤维素能力的细菌，确定各株细菌的产纤维素酶活力，利用产纤维素酶菌株制备微生物菌剂、腐熟剂，秸秆腐熟后可以作为有机肥还田，能够改善农田土壤肥力，减少化肥的施用，讲求环境效益的同时也兼顾了经济效益。因此，从生境中筛选并培育产纤维素酶的菌株，对更加有效地利用纤维素这一可再生资源具有重要的实践意义。

1 材料与方法

1.1 试验土样

土样取于辽宁省沈阳市浑南区祝家街道秸秆还田土壤。

1.2 样品预处理与菌株的分离纯化

将土壤样品中的草根、小石子拣出，后过1mm土壤筛。称量5g土壤样品加入到45mL无菌水中，置于恒温摇床中震荡30min。采用稀释涂布平板法筛出土样中的细菌菌株并进行分离纯化。

1.3 纤维素降解菌的初筛

将纯化后的菌株采用点接种法接种于CMC-Na培养基上，培养3d，待菌株长出后，用刚果红染色法与滤纸崩解测试[7]进一步筛选分离菌株。

1.4 纤维素降解菌的复筛

参考薛潘[8]测定CMC-Na酶活力与FPA酶活力的方法，测定各菌株的2种酶活力的大小。

1.5 菌株拮抗试验

取4个牛津杯小心放置在指示菌平板上，向1号牛津杯中注入80μL的无菌水作对照，另外3个牛津杯中分别注入已过滤的受试菌菌液80μL。37℃培养24h，若牛津杯周围出现抑菌圈(透明圈)，说明菌株拮抗。测定抑菌圈大小来判断其拮抗效应的大小。

1.6 细菌生长曲线的测定

提前制备种子菌液，后按照1∶100的比例接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中进行培养，并设置一个不接种菌液的空白样。从接种开始计时，每1h取1次样，分别为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14，共15次取样，测定菌液的OD600值，以取样时间为横坐标，OD600值为纵坐标绘制细菌的生长曲线。

1.7 细菌生理生化特征测定

参照《常见细菌系统鉴定手册》[9]进行菌株生理生化鉴定。

1.8 数据分析

使用Excel 2016对菌株各项实验所得数据统计、计算并制作图表。使用SPSS 23.0对数据进行差异性Duncan分析。

2 试验结果与分析

2.1 纤维素降解菌的初筛

将分离出的菌株接种到CMC-Na平板上，筛选出4株具有解纤维素能力的细菌菌株AX-9、AY-15、AZ-18、AZ-19。将4株细菌置于28℃环境下，36h内均有菌株生长。测定每株细菌透明圈与菌落的直径比值，见表1，AX-9的透明圈比值最大，为1.78，说明该菌株在4株细菌中解纤维素的能力最强，有较好的产纤维素酶的能力；其次是AZ-18，透明圈比值为1.55；AY-15的透明圈比值最小，为1.13，说明其解纤维素的能力最弱。

表1 不同菌株的菌落与透明圈大小

对于初筛得到的4株细菌，在滤纸条作为唯一碳源的培养基中，各菌株均能将滤纸条崩解，但崩解速率略有差异，失重率结果各不相同，见表2，滤纸崩解失重率与菌株降解滤纸纤维素的能力大小成正比。其中AX-9生长速度较快，培养至6h时，培养基可见浑浊，说明菌株已经开始繁殖生长；培养至36h时，培养液中出现了粘稠物质，菌株逐渐开始利用滤纸纤维素生长；培养至72h时，长方形滤纸条开始变薄，呈现圆角，中间出现裂痕，可见不规则的滤纸小碎片；培养至96h时，滤纸条已被打断，成若干圆形碎片；培养至120h时，培养基中部分滤纸片已成絮状，培养基已非常浑浊，见图1。研究发现，菌株在前72h滤纸崩解效果不明显，从第72小时开始，滤纸崩解速度明显增快。分析其原因，可以认为菌株在刚接种于滤纸纤维素作为唯一的碳源的培养基中时，无法利用滤纸这一碳源进行生长繁殖代谢。但随着时间的延长，菌株不断适应滤纸作为唯一碳源的生长环境，因此在培养的第72小时开始，滤纸的崩解速度明显增快。根据公式计算得到各菌株培养5d后的滤纸失重率，AX-9滤纸失重率是4株细菌中最大的，见图1a，为18.96%，说明其降解滤纸纤维素的能力在4株细菌中是最强的；其次是AZ-19，滤纸失重率为16.82%，见图1b；AY-15的滤纸失重率最小，为13.78%。初步认为AX-9与AZ-19具有较好的产纤维素酶能力。

表2 不同菌株的滤纸崩解失重率

图1 菌株滤纸崩解5d结果

2.2 纤维素降解菌的复筛

在一定范围内，利用葡萄糖含量和吸光度呈线性关系来确定菌株保温酶解反应所生成的葡萄糖的含量，获得线性回归方程，见图2。葡萄糖标准曲线方程：

y=0.4403x-0.0156(R2=0.9991)

以CMC-Na为唯一碳源，测定初筛得到的4株细菌的CMC-Na酶活力，见图3a。AX-9菌株CMC-Na酶活显著高于其他菌株酶活，为6.18±0.13U·mL-1；其次是AZ-19与AZ-18，酶活力分别为5.37±0.17U·mL-1、5.02±0.17U·mL-1，但二者酶活力差异不显著；最低的是AY-15，酶活力为4.39±0.09U·mL-1。

以滤纸为唯一碳源，FPA酶活的测定呈现了相同的趋势，见图3b，AX-9的FPA酶活力显著高于其他菌株酶活，为2.94±0.08U·mL-1；其次是AZ-19，酶活力2.42±0.09U·mL-1；而AY-15与AZ-18差异不显著，且酶活力较低，分别为1.79±0.07U·mL-1、1.88±0.10U·mL-1。

2.3 菌株拮抗试验

分别将AX-9与AZ-19作指示菌，另一菌株作受试菌，共4组试验，每组试验3个平行，对比无菌水空白样(A)，均未见有牛津杯周围有抑菌圈的产生，见图4，说明菌株间无明显拮抗作用，AX-9与AZ-19可组合培养，可进行复合菌剂的制备。

图2 葡萄糖标准曲线

注：图中字母表示在0.05水平上差异显著，ab表示相同处理间从大到小的显著差异。

图4 AX-9与AZ-19菌株拮抗试验

2.4 细菌生长曲线

菌株AX-9在0～3h生长繁殖缓慢，从第3小时开始大量繁殖，进入生长对数期，第11小时开始菌株的生长繁殖速度下降，进入生长平缓期；AZ-19相较于AX-9进入生长对数期时间长，在第4小时进入生长对数期，在第12小时进入生长平缓期。2株细菌生长对数期时间均为8h，见图5。

2.5 细菌形态学观察

菌株AX-9为好氧菌，在NB培养基上直接观察，四区划线菌落连续，凸起呈乳白色，可见表面湿润且质地粘稠，边缘整齐，对其进行革兰氏染色发现，AX-9为革兰氏阳性菌，无动力，细胞杆状，分散排列。菌株AZ-19为好氧菌，在NB培养基上呈黄色，可见单菌落，菌落凸起，表面较湿润，周围较光滑，不透明，通过革兰氏染色发现其为革兰氏阴性菌，无动力，细胞短杆状，分散排列。

图5 细菌菌株培养14h生长曲线

2.6 生理生化特征测定

将筛选出来产纤维素酶能力较高的细菌菌株AX-9与AZ-19进行生理生化特征测定。糖类分解试验中，AX-9与AZ-19的杜氏小管中无气泡生成，说明二者分解葡萄糖时均不产气，而AZ-19的检测试管可见添加溴百里香酚蓝指示剂的培养基由蓝变黄，说明其分解葡萄糖时产酸。V-P试验中，培养4d后滴加检测液检测，AZ-19立即呈现红色，为阳性反应，说明其分解葡萄糖产生丙酮酸，而AX-19在2h内仍无颜色变化，说明其为阴性反应。2株细菌在接触酶试验中均有气泡产生，为阳性反应。在淀粉水解试验中，2株细菌均为阴性反应，说明菌株不分泌胞外淀粉酶。在明胶液化试验中，AX-9液化明胶结果较AZ-19不明显，为部分液化，但均认定2株细菌为阳性反应，分泌明胶酶，见表3。初步将AX-9鉴定为芽孢杆菌属，AZ-19为黄色杆菌属。

表3 细菌菌株生理生化特征总表

3 结论

本研究筛选出的4株细菌均具有产纤维素酶的能力，其中AX-9与AZ-19有显著的纤维素降解能力。进行拮抗试验，研究发现二者之间可共生。本研究发现的菌株对充分利用纤维素这一潜在资源，改善自然环境，缓解不可再生资源大量消耗的现状，具有潜在的应用前景。