‘红阳’猕猴桃花粉生活力检测方法比较研究

郭丽娜，陈双庆，王邦霞

（六盘水师范学院生物科学与技术学院，贵州 六盘水 553004）

四川省自然资源科学研究院、苍溪县农业局、苍溪县科委联合选育的世界首个红肉型猕猴桃新品种‘红阳’属中华系品种，因酸甜可口、营养价值高深受消费者喜爱[1~3]。猕猴桃绝大多数品种为雌雄异株，主要依靠昆虫授粉，同时也利用风媒授粉。但花期不遇、雌雄比例不当、恶劣天气等容易导致授粉受精不良，而正常的授粉受精是猕猴桃雌株正常结果的前提条件和保证，是优质丰产的基础。目前仅仅依靠自然授粉并不能满足优质丰产的需要，人工辅助授粉就显得尤为重要[4，5]。多年来，国内外对猕猴桃授粉受精相关研究报道较多，从人工辅助授粉的采粉时期、花粉离体培养到花粉贮藏，都进行了比较系统全面的研究[6~14]，但对于‘红阳’猕猴桃花粉生活力的研究多年来一直未见报道。鉴于此，本研究以‘红阳’猕猴桃花粉为对象，探讨其最佳生活力测定方法，以期为‘红阳’猕猴桃花粉活力的检测、花粉前处理及人工辅助授粉提供参考依据。

1 材料与方法

‘红阳’猕猴桃花粉于2020年4月采自六盘水市米箩润永恒猕猴桃公司猕猴桃基地。

1.1 试验设计

1.1.1 花粉生活力不同测定方法的比较试验

TTC染 色 法(Triphenyltetrazolium Chloride，TTC)设10个浓度TTC染色液，即0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1.0%。参照李鹏[4]的方法。

I2-KI染色法(Iodine-iodidie Kalium，I2-KI)设3个浓度I2-KI染色液，即1.0%、2.0%、3.0%。参照杨红等[15]的方法。

无机酸测定法(Mineral Acid，MA)设3个浓度硝酸溶液，即0.6、0.8、1.0 mol/L。参照刘苇[17]的方法。

离体萌发法(Germination in Vitro，GIV)培养液浓度配比参照李鹏[4]的最佳培养液组分，筛选最佳硼酸浓度和pH值。首先设置pH值6.5，硼酸浓度为0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 g/L，25℃培养5 h，观察花粉萌发情况；然后根据筛选出来的硼酸浓度，将‘红阳’猕猴桃花粉置于不同pH值(4.0、5.0、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0)的培养液中，25℃培养5 h，观察花粉萌发情况。参照齐秀娟等[18]的方法进行花粉活力检测。

1.1.2 不同花粉生活力测定方法的比较试验

挑选与最佳离体萌发法检测结果相近的TTC染色法、I2-KI染色法和无机酸测定法处理，进行4种花粉生活力测定方法的比较研究，筛选出‘红阳’猕猴桃花粉生活力最佳测定方法。

1.2 数据分析

采用Spss19.0软件进行单因素方差分析，通过Excel 2010和Word 2010软件完成图表的制作。

2 结果与分析

2.1 TTC染色法

由图1可知，TTC染色液浓度为0.5%时，‘红阳’猕猴桃花粉生活力最高，为72.43%，极显著高于0.1%、0.2%、0.6%~1.0%三者处理(F=26.75，P＜0.01)，与0.3%、0.4%处理的差异不显著；0.1%、0.2%、1.0%TTC染色液浓度处理的‘红阳’猕猴桃花粉生活力最低，均在45%以下，0.9%处理的在50%以下，均极显著低于其他所有处理，说明TTC染色液浓度过低、过高都不利于准确检测‘红阳’猕猴桃花粉生活力。

图1 不同浓度TTC染色液对‘红阳’猕猴桃花粉生活力的影响

2.2 I2-KI染色法

不同I2-KI染色液浓度下检测的‘红阳’猕猴桃花粉生活力依次为86.00%、86.36%、85.87%，无显著性差异(F=0.20，P＞0.05)，说明I2-KI染色液所选浓度均有利于准确检测‘红阳’猕猴桃花粉生活力。在效果一致的情况下，宜选用浓度较低的，故I2-KI染色液浓度以1.0%~2.0%为宜。

2.3 无机酸测定法

由图2可知，1.0 mol/L硝酸处理的‘红阳’猕猴桃花粉生活力最高，为83.75%，极显著高于0.6 mol/L与0.8 mol/L硝酸处理的(F=18.32，P＜0.01)，后二者间差异不显著。

图2 不同硝酸浓度对‘红阳’猕猴桃花粉生活力的影响

2.4 离体萌发法

‘红阳’猕猴桃花粉生活力随硼酸浓度的增加呈先升后降的趋势(图3)。硼酸浓度为0.15 g/L时‘红阳’猕猴桃花粉生活力最高，为78.00%，极显著高于0.10、0.30 g/L硼酸处理的(F=5.60，P＜0.05)，但与0.20、0.25 g/L硼酸处理的差异不显著。

图3 不同硼酸浓度对‘红阳’猕猴桃花粉生活力的影响

‘红阳’猕猴桃的花粉生活力随pH值的升高呈先升后降的趋势(图4)。pH值6.5处理的‘红阳’猕猴桃花粉生活力最高，为82.98%，与pH值7.0处理的(78.33%)差异不显著，但极显著高于其余处理的(F=183.37，P＜0.01)，说明检测‘红阳’猕猴桃花粉生活力的最佳pH值为6.5~7.0。

图4 不同pH值对‘红阳’猕猴桃花粉生活力的影响

2.5 不同花粉生活力测定方法的比较

与最佳离体萌发法检测的结果相近的其他处理是:0.5%TTC染色液(TTC染色法)、1.0%~2.0% I2-KI染色液(I2-KI染色法)、1.0 mol/L硝酸(无机酸测定法)，将这3个处理检测的花粉生活力与pH值6.5、pH值7.0处理的‘红阳’猕猴桃花粉生活力进行比较，发现I2-KI染色法、无机酸测定法和离体萌发法(pH值6.5)检测的‘红阳’猕猴桃花粉生活力无显著差异，但均显著高于离体萌发法(pH值7.0)检测的结果(F=18.58，P＜0.01)；TTC染色法检测的‘红阳’猕猴桃花粉生活力极显著低于离体萌发法(pH值7.0)检测的结果(表1)。说明1.0%~2.0% I2-KI染色液(I2-KI染色法)、1.0 mol/L硝酸(无机酸测定法)和离体萌发法(pH值6.5)均能快速准确地测定‘红阳’猕猴桃的花粉生活力；TTC染色法不适于‘红阳’猕猴桃花粉生活力检测。

表1 4种测定方法测定的‘红阳’猕猴桃花粉生活力比较%

3 结论与讨论

3.1 不同花粉生活力测定方法的最佳处理

人工授粉前对‘红阳’猕猴桃花粉生活力进行准确快速鉴定对其生产有着至关重要的意义。花粉生活力鉴定方法目前有TTC染色法、I2-KI染色法、无机酸测定法及离体萌发法。李鹏[4]发现，经0.5%TTC染色液处理的中华猕猴桃花粉生活力最高。胡春等[19]发现，钝裂银莲花的花粉生活力随TTC染色液浓度的增加呈先升后降的趋势，TTC染色液浓度为0.5%时的花粉生活力最高。齐秀娟等[18]研究发现，美味猕猴桃花粉离体培养的适宜pH值为6.0~6.5。覃剑锋等[20]研究发现，花魔芋花粉离体萌发及花粉管伸长的最适pH值为6.5，大于6.5后花粉管长度逐渐降低。张露等[21]研究发现，矾根花粉离体萌发法的适宜pH值为5.0~6.5。本研究发现，TTC染色法测定‘红阳’猕猴桃花粉生活力的最佳浓度为0.5%TTC染色液，离体萌发法的最适pH值为6.5。与前人的研究结果基本一致。

不同植物花粉的I2-KI染色液及无机酸测定法最佳浓度不同。杨红等[15]发现，I2-KI染色液浓度为1.0%时中华猕猴桃的花粉生活力最高。王士泉等[22]和涂清芳等[23]发现，I2-KI染色液浓度为2.0%时，四川牡丹和8个菊花品种的花粉生活力均最高。本研究发现，不同I2-KI染色液浓度下测得的‘红阳’猕猴桃花粉生活力无显著性差异，均高达85%以上，与王士泉、涂清芳的研究结果一致，但与杨红的研究结果不一致。刘苇等[17]研究发现，0.8 mol/L硝酸处理的圭亚那柱花草花粉生活力最高。贺庆梅等[24]通过比较柱花草花粉在不同硝酸浓度下生活力的高低发现，0.6 mol/L硝酸处理的柱花草花粉生活力平均达94.19%。王永周等[25]研究发现，无机酸法适用于臭椿花粉生活力的测定，硝酸浓度为0.8 mol/L时花粉生活力最高。本研究发现，1.0 mol/L硝酸处理的‘红阳’猕猴桃花粉生活力最高(83.75%)，这与刘苇、贺庆梅、王永周的研究不一致。究其原因可能与植物花粉本身的特性有关，也可能受培养温度、时间等影响。

花粉萌发对授粉受精起着关键作用，不同植物花粉萌发时所需的硼酸浓度不同，适宜的浓度为0.05~0.15 g/L[26]。李鹏[4]与李平[27]研究发现，经0.15 g/L硼酸处理的中华猕猴桃和美味猕猴桃花粉生活力最高。本研究发现‘红阳’猕猴桃花粉经0.15 g/L硼酸处理后花粉生活力最高，与前人的研究结果基本一致。

3.2 不同花粉生活力测定方法的比较

本研究发现，利用离体萌发法测得的花粉活力高达80%以上。离体萌发法对于花粉培养条件要求高，且费时，虽不能快速检测花粉活力，但其检测结果可作为标准，用来确定测定‘红阳’猕猴桃花粉生活力的最佳方法。试验结果表明，1.0%~2.0% I2-KI染色液(I2-KI染色法)、1.0 mol/L硝酸(无机酸测定法)和离体萌发法(pH值6.5)检测的‘红阳’猕猴桃花粉生活力均在80%以上，说明I2-KI染色法和无机酸测定法均能快速准确地测定‘红阳’猕猴桃的花粉活力。李成忠等[28]认为，TTC染色法因其对花粉质量要求高，导致难以准确测定花粉活力。李鹏[4]综合比较TTC染色法和离体萌发法发现，离体萌发法更适合中华猕猴桃与美味猕猴桃花粉活力的测定。本研究发现TTC染色法测得的‘红阳’猕猴桃花粉生活力极显著低于离体萌发法的结果，这与李鹏的研究结果一致。说明TTC染色法不适于‘红阳’猕猴桃花粉检测。