基于代谢组学技术对晒青茶加工过程的代谢物分析

刘学艳，吕才有

1. 滇西科技师范学院 生物技术与工程学院，云南 临沧 677000；2. 云南省红茶工程技术研究中心，云南 临沧 677000；3. 云南农业大学 茶学院，云南 昆明 650100

云南省主产茶区集中在澜沧江流域，大部分茶园分布于山区与半山区，机械化推广难度较大，机械化采摘技术成为云南茶产业发展的瓶颈。云南茶产品以普洱茶为主，其中以春季鲜叶制成的普洱茶最受消费者青睐。夏、秋茶由于茶多酚等含量较高，制成的茶产品苦涩味较重，再加上手工采摘成本较高，大量的夏、秋茶资源被浪费[1]，严重影响了云南省茶产业的经济效益。云南省普遍推广种植的‘云抗10号’（占云南省无性系良种的89.4%），其抗性强、长势均匀[2]，利于机械化采摘；制成的普洱生茶清香浓郁，滋味醇正，汤色黄亮；制成的普洱熟茶香气醇正、陈香，汤色红浓明亮，滋味醇厚[3]。

晒青毛茶的加工主要包括鲜叶摊晾、杀青、揉捻及日光干燥等。其中，杀青工序对晒青毛茶品质影响最大，揉捻工序会影响晒青毛茶的外形，也在一定程度上影响晒青毛茶的口感；日光干燥工艺保留了茶叶的内含成分，更有利于普洱茶后期加工及存放过程中内含物质的转化[4]。随着普洱茶品牌价值的提升，传统的手工加工方式不仅无法满足巨大的需求量，也无法保证普洱茶的质量，晒青茶的生产逐渐向标准化、机械化作业发展，生产过程逐步趋向车间无人化[5]。

晒青茶的品质受茶树品种[6]、生长年限[7]、加工方式、储存时间等因素的影响。这些因素会引起晒青毛茶中咖啡碱、氨基酸、茶多酚、可溶性糖等呈味物质以及叶绿素等呈色物质的含量及比例变化，进而影响茶叶品质及口感[8]。其中，晒青茶最独特的“日晒味”品质特征的形成，与日光干燥有着密切的关系。跟炒干、烘干相比，日光干燥方式温度更低，更有利于晒青茶后期物质的转化。坤吉瑞[9]等研究了日光干燥、晒青棚干燥和晒青棚内加紫外灯干燥3种晒干方式对晒青绿茶的品质影响，发现不同干燥方式会影响晒青茶内脂肪酸、挥发性香气物质和感官审评结果，且使用晒青棚内添加紫外灯照射处理下可以增加成品茶中醛类挥发性香气物质，获得更好的感官风味。已有研究表明，云南大叶种晒青茶含有比其它茶类更高的多酚类活性物质，其提取物有较强的抗氧化活性，可有效清除超氧阴离子、羟基自由基、DPPH自由基、抑制黄曲霉毒素生长[10]。马超龙[11]采用GC-MS技术分离鉴定了晒青毛茶加工过程中6个在制样品共得到113种香气化合物，主要是醇类、醛类、酯类、烯类等，并且醇类香气物质在加工过程中变化最为明显。

目前大量的研究集中在晒青茶的加工工艺、生化成分、挥发性物质及保健功效等方面，对于晒青茶在加工过程中的代谢物变化情况研究甚少。本研究以‘云抗10号’茶树鲜叶制成的晒青毛茶为研究对象，采用代谢组学技术对其加工过程中的代谢物进行深入检测和分析。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

2020年9月，在德宏芒市四季茶业有限公司生产车间将机械采摘的‘云抗10号’大叶种鲜叶使用机械化加工生产线加工制成晒青毛茶。机采鲜叶先平铺摊晾（以10 ～ 15 cm的厚度摊放 8 h，摊放过程中进行 2 ～ 3 次通沟散热），之后输送至滚筒杀青机杀青（杀青温度180℃，杀青速度50 Hz，杀青时间3 min），再经摊晾机输送至回潮机（回潮时间约15 min），随后输送至揉捻机进行揉捻（先轻揉5 min，再重揉约20 min，再轻揉5 min），解块后输送至晒青棚内日光干燥制成晒青毛茶（以3 cm的厚度平铺在竹席上，日晒至足干）。分别取摊晾叶、杀青叶、揉捻叶、干燥叶各20 g，每份样品重复选取3次，置于液氮中保存，之后对样品进行代谢物提取鉴定。样品信息及编号如下（表1）。

表1 样品编号Table 1 The number of samples

主要仪器：5424R 2 Eppendorf型离心机，艾本 德 中国 有限 公 司；SHIMADZU Nexera X2型超高液相UPLC，日本岛津；Applied Biosystems 4500 Q TRAP 型串联质谱 MS，美国AB SCIEX。

主要试剂：甲醇（色谱纯，Merck）、乙腈（色谱纯，Merck）、标准品（色谱纯，BioBioPha/Sigma-Aldrich）、KH2PO4、Na2HPO4·12H2O、茚三酮、酒石酸钾钠和氯化亚锡，分析纯。

1.2 广泛靶向代谢组学检测

1.2.1 LC-MS样品提取

将茶样放置于真空冻干机中冷冻干燥——用研磨仪研磨（30 Hz，1.5 min）至粉末状——称取 100 mg 粉末，溶解于 1.2 mL 70% 甲醇提取液——每30 min涡旋1次（持续30 s），涡旋6次后将样本放置于4℃冰箱过夜——离心（转速12000 rpm）10 min后，吸取上清液，用微孔滤膜（0.22 μm）过滤样品，并保存于进样瓶中，用于UPLC-MS/MS分析。

1.2.2 LC-MS/MS色谱分析

主要利用超高效液相色谱（UPLC）和串联质谱（MS）两种数据采集系统。具体条件：色谱柱 Agilent SB-C18 1.8 μm，2.1 mm*100 mm；流动相A相：超纯水（加入0.1%的甲酸）；B相：乙腈（加入0.1%的甲酸）；洗脱梯度0.00 min B相比例为5%，9.00 min内B相比例线性增加到 95% 并维持在 95% 1 min，10.00 ～ 11.10 min B相比例降为5%，并以5%平衡至14 min；流速 0.35 mL/min，柱温为 40℃；进样量为 4 μL。

1.2.3 质谱条件

由三重四极杆线性离子阱质谱仪（Q TRAP）、AB4500 Q TRAP UPLC / MS / MS 系统扫描获得代谢物信息。ESI源具体操作参数为：离子源为涡轮喷雾；离子源温度为550℃；离子喷雾电压（IS）为正离子模式5500 V，负离子模式 -4500 V；离子源气体为 I（GSI）50 psi、II（GSII）60 psi、帘气（CUR）25 psi。

1.2.4 差异代谢物筛选方法

利用多维统计VIP值、单维统计P值及差异倍数FC来筛选差异代谢物，选取VIP＞1，P ＜0.05，FC≥2或FC≤0.5的代谢物为差异代谢物。

1.2.5 代谢物定性和定量方法

利用软件Analyst 1.6.3处理质谱数据，获得不同样本的代谢物质谱分析数据后对所有物质的质谱峰进行峰面积积分，并对其中同一代谢物在不同样本中的质谱出峰进行积分校正。

1.3 数据分析

采用 SPSS 22.0、GraphPad Prism 7 两个分析软件进行差异显著性分析和绘图。使用Analyst 1.6.3处理代谢物的质谱数据，采用UV归一化处理代谢物含量数据，使用R软件分析数据并绘制热力图。

2 结果与分析

2.1 样本质控及统计分析

通过对“摊放叶”“杀青叶”“揉捻叶”“干燥叶”四组样品进行代谢物提取后，再对样本的代谢物进行质谱定性定量分析。图1为样品中所检测到的代谢物多峰图，图中每个不同颜色的质谱峰代表检测到的一个代谢物，每个色谱峰的峰面积代表对应物质的相对含量。

图1 检测到的代谢物多峰图（A：正离子模式，B：负离子模式）Figure 1 Metabolic peaks detected（A: positive ion mode，B: negative ion mode）

2.2 正交偏最小二乘法判别分析（OPLS-DA）

OPLS-DA分析对于相关性较小的变量更敏感，可以使组间区分最大化，有利于寻找差异代谢物。本实验先建立了四组茶样之间的PLSDA模型，评价模型的预测参数如表2。其中R2X和R2Y分别表示所建模型对X和Y矩阵的解释率，Q2大于0.9即为出色模型。本次试验中四组样品的Q2均大于0.9，进一步说明四组模型构建良好，具有较高的预测能力。

表2 样本分组比较的R2值和Q2值Table 2 The calculated R2 and Q2 values of different groups

为避免PLS-DA模型出现过拟合现象，本研究建立了四组样本的OPLS-DA-plot（图2），判断代谢物对于每个分组的贡献率。其中，红色表示VIP≥1的代谢物，绿色表示VIP ＜ 1的代谢物。根据OPLS-splo图，四组样品中红色点和绿色点在各个模型中的数量和分布范围不同，说明差异代谢物对模型的贡献率不一样，即模型建立成功，可根据VIP值筛选差异代谢物。此外，PLS-DA模型和opls-splot模型相互验证，说明对加工过程中各个阶段的样本进行代谢物分组比较是可行的，且各组存在明显差异，得到的差异代谢物具有统计学意义。

图2 三组样品OPLS-splo图Figure 2 OPLS-SPLO diagram of each group

2.3 差异代谢物的筛选

基于VIP值，结合单变量分析的差异倍数值FC来进一步筛选出差异代谢物。本实验选择VIP大于1，FC≥2或者FC≤0.5的代谢物进一步分析。FC≥2和FC≤0.5表示代谢物在对照组和实验组中差异为2倍，都表示差异显著。根据此筛选标准，在四组样品中筛选到的差异代谢物个数如下（表3）。

表3 四组样品差异代谢物数量Table 3 Differential metabolites in four groups of samples

2.4 秋季晒青茶加工过程中主要代谢物含量变化

2.4.1 萜类代谢物

如图3所示，萜类物质在加工过程中，京尼平、白桦脂酸、山楂酸含量存在显著性变化。京尼平和山楂酸两种物质在杀青过程中含量显著上升，揉捻过程中含量稍微下降，干燥过程中又快速下降。白桦酸酯相对含量在杀青、揉捻过程中持续升高，干燥过程中下降。

图3 萜类代谢物在加工过程中的变化Figure 3 Changes of Terpene Metabolites during Processing

2.4.2 生物碱类代谢物

本研究中检测到的生物碱类差异代谢物中含量变化较大的是2-氨基嘌呤、烟酸甲酯、吲哚-3-甲醛、色胺、吲哚-3-乙酸、3-羟丙基棕榈酸酯和对香豆酰基腐胺。其中，3-羟丙基棕榈酸酯和2-氨基嘌呤在加工过程中变化比较显著。这两种物质在摊放叶中含量极高，随着杀青揉捻的进行，含量逐渐降低。色胺类物质含量在杀青过程中明显升高，揉捻和干燥过程中又逐渐降低。总体上看，生物碱类物质在加工过程中相对含量逐渐降低。

图4 生物碱类代谢物在加工过程中含量变化Figure 4 Changes of Alkaloids metabolites during processing

2.4.3 氨基酸及其衍生物类代谢物

氨基酸是茶叶中非常重要的呈味物质之一，主要影响茶叶的鲜味和甜味。氨基酸类代谢物在加工过程中代谢物含量变化如图5所示。其中，还原性谷胱甘肽在杀青过程中快速升高，干燥过程中又快速降低；L-苏氨酸、L-蛋氨酸、S-腺苷-L-蛋氨酸、L-天冬氨酸-O-二葡萄糖苷这几种物质的含量很高，在加工过程中的变化也非常快。S-腺苷-L-蛋氨酸的相对含量在摊放叶、杀青叶、揉捻叶中变化不是很大，在干燥过程中快速降低。

图5 氨基酸及其衍生物类代谢物在加工过程中变化Figure 5 Changes of amino acids and their derivatives during processing

2.4.4 部分黄酮类代谢物

黄酮类物质的种类和含量是所有代谢物中最丰富的，也是对茶叶品质影响最大的。本研究中检测到的黄酮类在加工过程中变化趋势如图6。从图中可看出，晒青茶加工过程中黄酮类物质的变化幅度很大，山奈酚、圣草酚、高车前素、香叶木素、鼠李柠檬素、花旗松素这几种物质在各组样品中含量很高，变化也很快。其中，杜鹃黄素、花旗松素、鼠李柠檬素、香叶木素、高车前素、五羟基查尔酮、圣草酚、阿夫儿茶精这几种物质都在杀青过程中达到了最大值，随后逐渐降低。部分物质如鼠李柠檬素、高车前素、圣草酚、香叶木素、丁香亭等虽然在揉捻过程中含量有所降低，通过干燥工序后相对含量又增加。总体上看，大部分黄酮类物质在杀青过程中含量快速增加，在揉捻和干燥过程中逐渐降低。

图6 部分黄酮类代谢物在加工过程中代谢物变化Figure 6 Changes of flavonoid metabolites during processing

2.5 代谢物KEGG功能注释及富集分析

差异代谢物在生物体内相互作用，形成不同的通路，通过查询KEGG相关代谢通路数据库可以对差异代谢物进行注释，还可以将代谢物作为一个整体网络进行研究。本实验中四组样品的差异代谢物通路如图7（图中纵坐标为KEGG代谢通路的名称，横坐标为注释到该通路下的代谢物个数及其个数占被注释上的代谢物总数的比例）。

根据图 7（a）可知，TF vs SQ 中有 94种差异代谢物分别被注释到33条代谢通路，主要包括嘌呤代谢、谷胱氨酸代谢、维生素代谢、类黄酮生物合成及苯丙酸合成。其中，黄酮生物合成路径中注释到的代谢物种类较多。由图7（b）可知，在SQ vs RN组中有23种代谢物分别被注释到9条代谢通路中。在揉捻过程中，以物理作用为主，化学反应为辅，所以差异代谢物很少。硫胺代谢、嘧啶代谢、苯丙酸合成、黄酮和黄酮醇代谢、精氨酸和脯氨酸代谢、α-亚麻酸代谢几条代谢路径中各被注释到一种差异代谢物。由图7（c）可知，RN vs SG组有90种代谢物分别被注释到42种代谢通路中，主要包括玉米素合成、色氨酸代谢、单环菌素合成、谷胱甘肽代谢、蛋氨酸和精氨酸代谢、苯丙酸等氨基酸生物合成、维生素C合成、2-氧代环戊烷羧酸甲酯合成。其中，黄酮和黄酮醇类生物合成、氨基酸代谢、嘧啶代谢、嘌呤代谢是四组样品中主要和共有的代谢通路类型。

图7 三组样品的KEGG代谢通路及富集到的代谢物所占比例Figure 7 The proportion of KEGG metabolic pathway and enriched metabolites in three groups of samples

2.6 部分差异代谢物通路及其与茶叶品质的关系

2.6.1 摊放工序与晒青茶品质形成的关系

本实验中，代谢组学技术检测到的摊放叶代谢物包括酚酸类、黄酮类、氨基酸及其衍生物类、有机酸类、生物碱类、脂质类等。摊放叶中含有相对含量较高的D-赤酮酸内酯、2-氨基乙烷磺酸、6-羟基己酸、2-氧代己二酸、磷酸烯醇式丙酮酸等5种有机酸类物质，3-羟丙基棕榈酸酯两种生物碱，丁香亭、柠檬素等黄酮类物质，这些物质是茶叶品质形成的基础。

2.6.2 杀青工序与晒青茶品质形成的关系

在晒青茶的加工过程中，杀青工序对茶叶的品质影响最大。杀青过程中，氨基酸类代谢物在加工过程中含量变化很大，其中，L-苏氨酸通过丝氨酸和苏氨酸代谢途径以及单杆菌酰胺生物合成途径，相对含量显著升高。根皮素通过类黄酮生物合成途径显著上调，使得“杀青叶”中的根皮素代谢物含量远高于“摊放叶”。通过查询杀青工序促进的物质代谢通路，还原型谷胱甘肽、L-蛋氨酸亚砜、蛋氨酸、S-腺苷-L-蛋氨酸、甲硫腺苷、1-氨基环丙烷羧酸、S-腺苷-L-高半胱氨酸主要通过氨基酸及其衍生物类生物合成途径完成代谢。

2.6.3 揉捻工序与晒青茶品质形成的关系

揉捻工序主要是利用外力按照不同茶类的加工需求使用不同的揉捻方式将杀青过的茶叶揉捻成形，主要发生物理变化。通过LC-MS技术对代谢物的检测分析，大部分代谢物在揉捻过程中含量变化不明显，只有少数物质含量发生了显著性变化。整体上看来，黄酮类物质在揉捻过程中变化比较明显，主要是丁香亭、杜鹃黄素、香叶木素、高车前素、五羟基查尔酮、圣草酚、鼠李柠檬素、花旗松素、溶血磷脂酰胆碱、槲皮素-7-O-芸香糖苷-4'-O-葡萄糖苷、胸腺嘧啶、儿茶酚等含量显著升高。其中，4-甲基-5-(beta-羟乙基)噻唑通过硫胺代谢途径显著上调。其中，N-(4-氨基丁基)-乙酰胺在生物合成途径中表现为显著上调。少数物质在揉捻过程中相对含量降低。其中，丁香亭、2’,4’,6’,3,4-五羟查耳酮通过类黄酮生物合成途径、阿魏酸通过苯丙酸合成途径含量降低。

2.6.4 干燥过程与晒青茶品质形成的关系

干燥过程中，发生显著性变化的物质是氨基酸类、黄酮类。其中，磷烯醇丙酮酸在糖酵解途径中显著升高，2-脱氧-D-核糖 5-磷酸酯二钠盐通过磷酸戊糖途径含量显著升高。葡萄糖醛酸内酯、抗坏血酸、脱氢抗坏血酸含量通过抗坏血酸代谢途径显著升高。

3 讨论

通过LC-MS检测结果，晒青茶加工过程所有在制品共有649个差异代谢物。在摊放过程中，茶叶细胞膜渗透能力增强，酶活性增强，淀粉、多酚类、多糖、蛋白质、果胶、酯类等物质产生以酶促水解为主的氧化降解，生成对晒青茶品质有重要作用的简单物质[12]。杀青是影响茶叶品质最重要的因素。本次研究中杀青采用滚筒杀青，热源为木柴，人工添加木柴无法保证温度的恒定。前人研究表明，不同热源的杀青机热效率不同，会影响茶叶的色泽和香气[13]。机采鲜叶老嫩混杂，滚筒杀青时无法保证所有鲜叶都能均匀杀青，因此，机采鲜叶的杀青可以考虑使用叶飞等研制的电磁滚筒耦合热风杀青方式来提高机采晒青茶的滋味和香气[14]。

杀青过程中，高温抑制了部分酶的活性，大分子物质氧化降解。氨基酸类通过美拉德反应生成糖胺类物质，带有青草气的酚酸类（阿魏酸、扁桃酸、异阿魏酸）和脂肪酸类代谢物含量下调。杀青叶“青草味”散失的主要原因可能就是这些酸类物质在高温作用下降解形成带花香的香叶醛、壬醛、苯甲醛[15]。水杨酸甲酯在杀青过程中含量也明显下调，具有花果香的橙花叔醇、香叶基丙酮、顺式茉莉酮、香叶醛、柠檬醛等在杀青叶中上调，可能是晒青茶品质香气形成的基础物质[16]。HAN等研究表示，杀青还能促进类胡萝卜素香气前体降解[17]和糖苷水解[18]，形成带有栗香的芳樟醇、苯乙醇、香叶醇等物质[19-20]。

在揉捻过程中主要是借助外力促进茶叶成形，代谢物变化不大。其中，13S-羟基-9Z,11E,15Z-十八碳三烯酸、9,10-环氧十八碳二烯酸、9,12,13-三羟基-10,15-十八碳二烯酸这几种代谢物含量显著降低。这几种物质呈苦涩味，揉捻过程中转化降解，进一步降低了茶鲜叶的苦涩味。

干燥是在太阳光的作用下降低揉捻叶中的水分，内含物发生复杂的热化学作用提升晒青茶香气和滋味[21]。前人研究表明，脂肪酸氧化降解产物对改善茶叶风味品质具有重要作用[22]。在排除不良天气干扰的基础上，晒青棚内加设紫外灯进行晒青处理，可促进制品中的脂肪酸降解，进一步提高晒青茶香气品质，紫外线强度越大可能越有利于脂肪酸氧化分解为对应的香气化合物[23]。也有学者研究发现，人工光源干燥可以避免因天气条件造成的晒青茶品质差异从而调控和稳定晒青茶品质[24]。

大量研究表明，夏秋茶内含成分丰富（例如黄酮和黄酮苷类物质高于春茶[25]），部分代谢物具有良好的保健功效。如L-精氨酸具有抗炎功效[26]、槲皮素可以制成药物[27]，用于临床治疗人类肝部病毒疾病[28-29]，也可以用于动物疾病治疗[30]；山奈酚可以保护血管[31]、辅助治疗皮肤病[32]；花青素不仅可以作为色素，还可以作为医药成分辅助治疗肿瘤[33]。可见夏秋茶只要加以合理利用，可以通过液态发酵[34]、鲜叶固态发酵[35]等新的后发酵工艺或深加工工艺制成多元化产品，提高茶产业总体经济效益。

4 结论

基于代谢组学技术，通过OPLS-DA等多元统计分析方法，LC-MS仪器对茶叶样品的代谢物信息具有很高的灵敏度和稳定性，建立的实验模型可靠。四组样品共检测到649个代谢物，包括黄酮类、氨基酸及其衍生物类、核苷酸及其衍生物类、酚酸类、脂类、有机酸类。通过差异代谢物的筛选，五组样品之间有不同的差异代谢物。从加工工序来看，杀青工序对茶叶的代谢物影响最大，从摊放叶到杀青叶共检测到97种差异代谢物；其次是干燥工序，从揉捻叶到干燥叶共检测到71种差异代谢物；最后是揉捻工序，从杀青叶到揉捻叶共检测到23种差异代谢物。在整个晒青茶加工过程中，变化最明显的代谢物主要是黄酮类、氨基酸及其衍生物类、有机酸类。其中，山楂酸、京尼平、2-氨基嘌呤、色胺、对香豆酰基腐胺、3-羟丙基棕榈酸酯、L-苏氨酸、L-蛋氨酸、L-甘氨酰-L-异亮氨酸、N-乙酰-L-蛋氨酸、L-赖氨酸丁酸酯、还原型谷胱甘肽、S-腺苷-L-蛋氨酸、L-天冬氨酸-O-二葡萄糖苷、阿夫儿茶精、山奈酚、圣草酚、鼠李柠檬素花旗松素、香橙素、高车前素、香叶木素、丁香亭等这些物质在整个加工过程中变化最明显，是晒青茶品质形成的关键物质。通过KEGG代谢通路分析，样品之间的差异代谢物主要通过黄酮类生物合成、氨基酸类代谢、嘌呤代谢等几种代谢途径合成。其中，黄酮类生物合成途径中富集到的差异代谢物种类最多，部分代谢物可参与多个代谢途径，各组间有多条代谢通路一致，如精氨酸和脯氨酸等氨基酸类代谢、维生素类代谢、嘧啶代谢、黄酮和黄酮醇类代谢等。

综上，茶鲜叶中的内含物质在加工过程中通过氧化、降解、缩合、聚合等多种反应途径转化形成特定物质，影响晒青茶的色、香、味、形，形成晒青茶独特的“晒青味”。