以可可碱为主的潮州野生茶树资源的生化特征

黄亚辉，吴 凡，许泽辉，许俊清，曾 贞，莫晓丽

1.华南农业大学 园艺学院，广东 广州 510642；2.饶平县益康茶叶有限公司，广东 饶平 521000

野生茶种质资源一般是指芽叶经制作后可供饮用的山茶属（Genus Camellia Linn.）植物的野生群体，多为茶组（Camellia Sect. Thea (L.)Dyer）植物。茶鲜叶中的生化成分是茶叶品质的物质基础，也是茶树遗传信息的表达结果。茶多酚、茶氨酸、嘌呤生物碱等次生代谢产物具有抗氧化、神经调节等保健功效，其组分及含量也是影响茶叶适制性的关键因素[1]。此外，一些研究者通过生化成分分析对野生茶树的亲缘关系和进化层次进行较为初步的归纳，为茶树育种研究节省了宝贵的时间成本。杨春[2]在江华苦茶的研究中发现，江华苦茶与云南大叶种生化成分相似，其中儿茶素的组成表现较为原始，江华苦茶应属乔木型茶树向灌木型茶树进化的中间类型。在生物碱方面，可可碱含量较高亦属于较为原始的性状[3]。本研究通过对25份潮州野生茶树资源进行生化成分测定，旨在从中发掘特异茶树种质进而为资源的深入研究与利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本研究中的25份野生茶树资源来自潮州市凤凰山和饶平镇等地，随机编号1 ～ 25。采摘时间为2021年4月，采摘标准为一芽三叶。

1.2 仪器及试剂

高效液相色谱仪（M8500AA，安捷伦科技有限公司），紫外可见分光光度计（UVmini-1280，岛津公司），分析天平（GL323-1SCN，赛多利斯科学仪器有限公司），超纯水器（EPEDE2-20TS，南京易普易达科技发展有限公司），冷冻高速离心机（Heraeus-Multifuge X1R，赛默飞世尔科技公司）。主要试剂：色谱级甲醇（A452-4，赛默飞世尔科技公司），色谱级异丙醇（A451-4，赛默飞世尔科技公司），色谱级三氟乙酸（76-05-1，上海麦克林生化科技有限公司）。

试验所用标准品均购于上海源叶生物科技有限公司：可可碱（theobromine，Tb），咖啡 碱（caffeine，Cf）， 苦 茶 碱（Theacrine，Tc），茶叶碱（theophylline，Tp），儿茶素（catechin，C），表儿茶素（epicatechin，EC），表儿茶素没食子酸酯（epicatechin gallate，ECG），表没食子儿茶素（epigallocatechin，EGC），表没食子儿茶素没食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG），没食子酸（gallic acid，GA），没食子儿茶素（gallocatechin，GC），没食子儿茶素没食子酸酯（gallocatechin gallate，GCG），儿茶素没食子酸酯（catechin gallate，CG）。

1.3 试验方法

1.3.1 茶多酚及游离氨基酸总量的测定

采用微波杀青法处理鲜叶，并放入烘箱以80℃烘干6 h。磨样机磨碎后过80目筛，放入干燥器保存待测。依据GB/T 8313—2018，采用福林酚法测定茶多酚总量。依据GB/T 8314—2013，采用茚三酮法测定游离氨基酸总量。

1.3.2 嘌呤生物碱及儿茶素组分与含量测定

嘌呤生物碱：采用安捷伦C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色谱柱。流动相A为0.1%三氟乙酸水溶液，流动相B为甲醇，恒定梯度洗脱，即：0 ～ 40 min，流动相 B 为 10%。柱温25℃，流速 1 mL/min，检测波长 232 nm，上样量10 μL，色谱峰如图1(a)所示。

儿茶素：采用安捷伦 C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色谱柱。流动相A为0.1%三氟乙酸水溶液，流动相B为甲醇，梯度洗脱（以流动相 B 的比例进行标注），即：0 ～ 8 min，8%；8 ～ 20 min，8% ～ 13%；20 ～ 25 min，13%～ 20%；25 ～ 30 min，20% ～ 25%；30 ～ 35 min，25% ～ 30%；35 ～ 40 min，30% ～ 35%；40 ～ 45 min，保持35%。柱温38 ℃，流速0.8 mL/min，检测波长278 nm，上样量10 μL，色谱峰如图1(b)所示。

2 结果与分析

2.1 茶多酚及游离氨基酸总量

茶多酚及游离氨基酸相关数据见表1。经测定，25份潮州野生茶树资源的茶多酚总量在176.08 ～ 280.91 mg/g，平均含量为 227.19 mg/g；其中有3株茶树的茶多酚总量超过250 mg/g，分别是11号（280.91 mg/g）、7号（264.23 mg/g）和3号（250.42 mg/g）。儿茶素是茶多酚的主体成分，25份潮州野生茶树资源的儿茶素总量在 58.38 ～ 169.81 mg/g，平均含量为 111.70 mg/g。观察图1可知，2号、3号、7号和9号茶树茶多酚总量较高而儿茶素含量较低，推测含有较高比重的黄酮或花色素类物质。

表1 茶多酚、儿茶素、游离氨基酸及相关数据Table 1 Tea polyphenols, catechins, free amino acids and related data

茶树一芽二叶氨基酸总量一般在2% ～ 5%。本研究中游离氨基酸总量在2.0% ～ 2.9%，含量均较低，推测可能是因为采摘样本成熟度高（一芽三叶），当年春季雨水偏少且升温较快。游离氨基酸总量低可能使得潮州野生茶树所制茶叶的鲜爽度等受到影响。

2.2 嘌呤生物碱组分及含量

1号、10号、11号、12号、13号、15号、16号、17号、19号、22号和25号茶树均以咖啡碱为优势生物碱，其中1号、10号、11号、16号和22号的咖啡碱含量超过40 mg/g。10号茶树的咖啡碱含量达到56.64 mg/g，符合高咖啡碱（Cf ＞ 50 mg/g）茶树资源的标准[4]，可为高咖啡碱品种的选育提供材料。

图2 茶多酚及儿茶素总含量a. 茶多酚 b. 儿茶素Figure 2 Total content of tea polyphenols and catechinsa. tea polyphenols b. catechins

2号、3号、4号、5号、6号、7号、8号、9号、14号、18号、20号、21号、23号和24号茶树均以可可碱为优势生物碱，不含咖啡碱，可为选育无咖啡碱或低咖啡碱茶树品种奠定基础。目前尚未有高可可碱茶树资源的统一标准，若以高咖啡碱资源标准为参照，则2号、4号、5号、7号和9号茶树可被视为高可可碱茶树资源。

观察表2中可可碱与咖啡碱的数据可发现，以咖啡碱为主的资源可可碱含量很低，均不超过10 mg/g，其中有6份资源不超过3 mg/g；以可可碱为主的资源可可碱含量基本在40 mg/g以上。这可能是因为，在茶树的咖啡碱合成通路中可可碱为咖啡碱的上游产物，推测此现象是茶树的咖啡碱合成酶发生突变，失去N-1的催化能力[5]，无法将可可碱进一步催化生成咖啡碱，造成了可可碱的积累。

表2 嘌呤生物碱与儿茶素的组分及含量 （mg/g）Table 2 The composition and content of purine alkaloids and catechins （mg/g）

2.3 儿茶素组分及含量

如表1所示，以咖啡碱为主的资源儿茶素总量在 115.25 ～ 169.81 mg/g，以可可碱为主的资源儿茶素总量在 58.38 ～ 110.84 mg/g，以可可碱为主的茶树资源，其儿茶素总量均低于以咖啡碱为主的资源。在酯型儿茶素方面，以可可碱为主的资源酯型儿茶素总量主要集中在60 ～70 mg/g；而以咖啡碱为主的资源除17号与19号茶树外，均在90 mg/g以上，以可可碱为主的资源酯型儿茶素含量亦较低。在两类儿茶素比重方面，以咖啡碱为主的资源与以可可碱为主的资源无明显差异。

在25份潮州野生茶树资源中，1号茶树的EGCG含量接近10%，可作为高EGCG茶树选育的材料[6]。在鲜叶EGCG和ECG有一定含量的基础上，EGC含量与红茶成茶中的茶黄素含量呈极显著正相关[7]。EGC一般占茶叶干重的2%[8]，本研究中1号和25号茶树的含量超过3%，有望成为高茶黄素优质红茶新品种的育种材料。

此外，在以可可碱为主的资源中，EGCG的最高含量仅为32.55 mg/g（2号），明显低于以咖啡碱为主的资源（43.54 ～ 96.86 mg/g）。同时，未检测到咖啡碱的2号、3号、4号、5号、6号、7号、8号、9号、14号、18号、20号、21号、23号和24号茶树，伴随儿茶素EGC、ECG的缺失。EGCG含量低、儿茶素组分不全是此类茶树资源的显著特征。

3 讨论

3.1 潮州野生茶树资源的特性

咖啡碱为茶种（Camellia sinensis (L.) O.Ktze.）的优势嘌呤生物碱，占茶叶干重的2% ～4%。以可可碱为优势生物碱的茶种资源尚未见报道，但在其近缘植物中，‘毛叶茶’‘滇缅茶’‘秃房茶’（Camellia gymnogyna Chang）和‘紫果茶’（Camellia purpurea Chang）均以可可碱为优势生物碱，含量分别在6.8%、0.5%、3.2%和2.9%附近[9-10]。在儿茶素单体方面，茶种的优势儿茶素单体为EGCG，一般占茶叶干重的3% ～ 6%[11]。

在茶种近缘植物中，‘毛叶茶’的优势儿茶素单体为GCG，占茶叶干重的5.2%；‘秃房茶’的优势儿茶素单体为EGCG，占茶叶干重的2.8%；‘滇缅茶’的优势儿茶素单体为EC，占茶叶干重的1.1%；‘厚轴茶’（Camellia crassicolumna Chang）的优势儿茶素单体为EGC，占茶叶干重的1.57%；‘大理茶’（Camellia taliensis）的优势儿茶素单体为ECG，占茶叶干重的3.7%[12]。其中‘厚轴茶’和‘大理茶’以咖啡碱为优势生物碱。

参考以上研究，本研究中的25份野生茶树资源主要分为两类：

1号、10号、11号、12号、13号、15号、16号、17号、19号、22号和25号茶树以咖啡碱为主（1.9% ～ 5.7%），几乎不含可可碱。优势儿茶素单体为 EGCG，含量在 43.54 ～ 96.89 mg/g，儿茶素单体从高到低依次为EGCG、GCG、GC、ECG、C、EGC、CG和EC。综合生物碱及儿茶素特征，推测以咖啡碱为主的资源属于茶种。

2号、3号、4号、5号、6号、7号、8号、9号、14号、18号、20号、21号、23号和24号茶树以可可碱为主（3.0% ～ 5.6%），不含咖啡碱。优势儿茶素为GCG，含量在20.99 ～ 42.21 mg/g，儿茶素单体从高到低依次为GCG、EGCG、C、GC、EC和CG，未检测到EGC和ECG。在茶种近缘植物中，‘毛叶茶’以可可碱为优势生物碱，GCG为优势儿茶素单体。与‘毛叶茶’相比，普通茶种植物的可可碱及GCG含量很低，但二者的嘌呤生物碱及儿茶素特征较为一致。推测这种资源为茶种近缘植物或两者的天然杂交种，具体分类学定位有待进一步研究。

此外，以可可碱为优势生物碱并伴随儿茶素单体缺失或含量极低的现象，在茶的近缘植物中有类似报道。根据Zeng等[13]的研究，‘厚轴 茶’（Camellia crassicolumna Chang） 存 在明显的GC、C、GCG、CG缺失（未检出），‘秃房茶’存在明显的CG缺失且EGC、EC、ECG、CG的含量极低（不足1%）。茶树近缘种在儿茶素及嘌呤生物碱的种类及含量上都与栽培茶种存在显著差异。这种特质可能就是其所制茶叶风味表现不佳的原因之一。

3.2 以可可碱为主的潮州野生茶树的风味特征

可可碱和咖啡碱都可以与TAS2R苦味受体家族成员结合[14-15]，使茶汤呈现苦味，但同时适量咖啡碱对茶氨酸的鲜味有增益效果，咖啡碱与多酚氧化物形成的络合物可丰富茶汤风味（Yin et al., 2014）。儿茶素约占茶多酚总量的80%，占茶叶干重的8% ～ 26%，是茶叶的主体风味物质，儿茶素含量的高低决定着茶汤滋味的浓淡[16]。酯型儿茶素是茶汤苦味的主要来源，且其中EGCG和ECG的浓度与涩味高度相关[17]。氨基酸在茶汤中具有多种呈味特征，如：鲜、甜、酸、苦。谷氨酸和茶氨酸是茶汤中游离氨基酸的主体部分，主要呈现鲜味和甜味。

综合分析，以可可碱为主的潮州野生茶树儿茶素与氨基酸含量均较低，所制茶叶可能表现出滋味淡薄、苦味明显、鲜甜感不足的特征。

4 结论

本试验研究从25份潮州野生茶树资源发掘出高咖啡碱资源1份、高可可碱资源5份、高EGCG茶树资源1份及高EGC茶树资源2份，可为相关茶树品种的选育提供物质基础。根据生物碱模式不同，可将25份资源分为以可可碱为主和以咖啡碱为主两类。以可可碱为主的资源不含咖啡碱，优势儿茶素单体为GCG并伴随EGC和ECG的缺失，推测其为茶种近缘植物或两者的天然杂交种，具体分类学定位有待进一步研究。同时，儿茶素与氨基酸含量低、儿茶素组分不全的特性可能导致所制茶叶滋味不佳。可可碱具有与咖啡碱类似的保健功效，如利尿、抗炎、促进血管舒张等，但对中枢神经的刺激作用较弱，不至于产生明显的失眠、心悸等副作用。故在资源利用方面，其药用价值应更具开发前景。