ST6-40转基因棉花株系的获得与耐盐性鉴定

朱永红，吴慎杰，李 静，张换样，焦改丽，竹梦婕，秦丽霞

（1.山西农业大学 棉花研究所，山西 运城 044000；2.棉花生物学国家重点实验室，河南 安阳 455000）

棉花是世界上重要的经济作物之一，我国人口多耕地少，粮棉争地的矛盾一直比较突出。提高棉花品种的耐盐性，发展盐碱地植棉，拓宽植棉面积对于我国棉花生产以及粮食生产具有重要意义[1]。从“七五”开始，我国开始开展棉花耐盐碱育种工作，山东农业大学等单位已经育成了山农N0、2F502-2、商丘40一些耐盐性较好的品种[2]。然而，常规耐盐育种选育的棉花品种遗传基础狭窄，选育周期长，且常规品种耐盐能力很有限。而且传统的遗传育种方法并不能很有效地提高植株耐盐胁迫应答能力[3-4]。因此，利用基因工程技术培育棉花抗逆（高盐、干旱、低温等）新品种已经成为棉花育种领域的新趋势。

利用基因工程技术研发耐盐棉花品种，已经进行了大量的研究。例如，嗜盐孢子菌H+-PPase基因TsVP在高盐条件下可改善棉花根和茎的生长和光合活性。与野生型相比，转基因植物的膜离子泄漏和丙二醛水平降低，转基因植物有助于Na+和Cl−在液泡的隔离。TsVP的表达也提高了棉花的发芽率和存活率，在高盐环境下改善纤维质量。另一项研究表明，拟南芥液泡焦磷酸酶编码AVP1的表达改善了转基因棉花在盐胁迫下的生长和纤维产量[5]。ST6-40基因是采用功能基因挖掘的方法分离得到的。在盐胁迫下，基于小盐芥cDNA文库的表达，构建源种质cDNA表达文库，利用农杆菌介导法转化拟南芥，建立了超过125 000个独立株系组成的转基因种子文库，通过高通量遗传筛选法筛选耐盐株系，分离出多种耐盐株系，通过PCR扩增和测序鉴定小盐芥CDNA，分离得到了ST6-40基因。这种功能基因挖掘方法强调了表达基因的功能，因此克隆的基因与耐盐功能直接相关。在拟南芥过量表达ST6-40基因，植物根系长度、叶片及株高都有显著提高[6-7]，但有关其耐盐机理目前尚不清楚。

本研究拟将ST6-40基因转入棉花品种R15中，通过对获得的转基因株系进行多代的PCR鉴定和耐盐鉴定，以获得ST6-40基因能稳定遗传且耐盐性强的转基因棉花品系，旨在为培育抗逆性棉花新种质提供科学参考。

1 材料和方法

1.1 试验材料

R15，为山西农业大学棉花研究所利用陆地棉品种晋棉7号经过多代再生选育出的胚胎发生纯合系；陆地棉耐盐对照品种中99807，由中国农业科学院棉花研究所提供；pCB2004-ST6-40重组载体（图1），由中国科技大学生命科学学院实验室构建并提供；利用农杆菌介导法转化R15受体，并通过PCR检测[8]获得ST6-40转基因阳性棉花株系ST6-40-1～ST6-40-65。

图1 重组载体pCB2004-ST6-40示意Fig.1 Schematic representation of the recombinant vector pCB2004-ST6-40

1.2 试验方法

1.2.1 目的基因ST6-40的核苷酸序列和蛋白序列分析利用生物信息学对目的基因ST6-40（NCBI序列号：ACF23021.1）的核苷酸序列和蛋白序列进行分析。

1.2.2 农杆菌介导的棉花遗传转化法以R15为受体，以下胚轴为外植体，参考陈志贤等[9]的方法构建转基因棉花。T0按单株种植，并进行PCR检测[8]，检测结 果为阳性 的单株，后 代经T1、T2、T3连续3代按株行种植，先后进行叶片喷草铵膦除草剂抗性鉴定及目的基因PCR检测，检测结果全为阳性的植株确定为ST6-40转基因棉花纯合株系。

1.2.3 转基因棉花的PCR鉴定及纯合系筛选在超净台上取再生小植株2～3片嫩叶，CTAB法提取R15材料和转基因棉花的基因组DNA，并稀释至100 ng/μL。通过PCR和产物测序鉴定其纯合性，反应体系为25μL，包 括2.5µL 1×PCR buffer，1.5μL 1.5 mmol/L MgCl2，2.0μL 0.2 mmol/L dNTPs，0.5μL P1（0.2μmol/L）引物（表1），0.5μL P2引物（0.2μmol/L），2.0μL Template DNA，0.5μLTaqDNA聚合酶，15.5μL ddH2O。PCR反应程序为：95℃预变性3 min；循环扩增阶段：95℃40 s→58℃30 s→72℃60 s，循环35次；最后72℃延伸保温7 min。扩增产物用1.0%琼脂糖凝胶进行电泳检测。

1.2.4ST6-40转基因棉花RNA水平上的鉴定取0.05～0.10 g的幼嫩叶片，分别按照RNA抽提试剂盒（TransZol Plant ET121，Trans）和cDNA一链合成试剂盒（Cat#PR037A，TaKaRa）说 明 提 取RNA并反转录为cDNA。采用SYBR Green Su‐permix（大连宝生物公司）进行定量PCR反应。反应体系为10µL：包括1.0µL 1×PCR buffer，1.0μL 1.5 mmol/L MgCl2，1.0μL 0.2 mmol/L dNTPs，0.2μL P1（0.2μmol/L）引物（表1），0.2μL P2引物（0.2μmol/L），1.0μL Template DNA，0.2μLTaqDNA聚合酶，5.4μL ddH2O。反应程序：95 °C 20 s；94 °C 3 s，60 °C 30 s，扩增40个循环。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

1.2.5 转基因棉花耐盐性鉴定T1、T2转基因阳性植株采用盆栽种植，在花铃期用300 mmol/L NaCl浇灌胁迫7 d后采用酸性茚三酮法[10]测定叶片游离脯氨酸含量，以判断棉花耐盐性差异，游离脯氨酸含量高的品系判定为耐盐性较好。

1.2.6 T3转基因棉花耐盐性鉴定将T3阳性纯合株系转基因棉花及受体对照种子播种于育苗盘中，每个待测材料进行3次重复，每个重复种50株，试验管理按照转基因生物安全要求进行。80%苗长至2叶时，将育苗盘放入底部隔水的盐池，在盐池底部浇入1.5%的盐水，盐水以刚没过育苗盘为准。施盐后7 d调查棉苗受害情况，每个待测材料调查3个重复，每个重复随机调查20株。根据棉花盐害分级方法和盐害指数计算方法，计算待测棉花材料的盐害指数。利用SPSS 22.0统计分析软件对试验结果进行方差分析。盐害分级症状描述如下：0级，棉苗无黄叶；1级，有1片子叶发黄；2级，2片子叶均发黄；3级，有1片子叶受害脱落；4级，有2片子叶受害脱落。

2 结果与分析

2.1 目的基因ST6-40生物信息学相关分析

目的基因ST6-40（（NCBI序列号：ACF23021.1）cDNA全长为510 bp，编 码169个 氨 基 酸，分 子 质量为18 124.08 u，理论等电点为8.66，分子式为C813H1325N209O244S6。对转基因阳性植株进行测序，结果显示，其序列与NCBI数据一致，没有基因突变。

2.2 T0的ST6-40转基因棉花PCR鉴定

对200棵T0转基因植株进行PCR鉴定，共获得65个阳性株系，转化率为19%。如图2所示，10个T0转基因再生苗中，L1和L35为阴性转基因棉花，其余为阳性转基因棉花。进一步将获得的T0阳性棉花再生苗嫁接到温室内，其中有60株收获到种子。

图2 T0转基因棉花PCR检测Fig.2 PCR detection of T0 generation of transgenic cotton

2.3 稳定遗传的后代转基因棉花鉴定

2.3.1 T1、T2转基因棉花鉴定对60个T1转基因株系进行PCR鉴定（图3），共得到48个T1的ST6-40转基因棉花阳性株系，其中，34个T1转基因阳性株系的脯氨酸含量高于对照，且L2、L5、L14、L18、L22、L26、L29、L47共8个株系的脯氨酸含量显著或极显著高于对照（P<0.05或P<0.01）（表2）。

对34个T2转基因株系进行PCR鉴定，结果均为阳性转基因棉花（图3），其中31个的游离脯氨酸含量高于对照R15，且L2、L5、L14、L18、L22、L29、L55、L56共8个株系的脯氨酸含量显著或极显著高于对照（P<0.05或P<0.01）（表2）。

图3 T1～T3转基因棉花在分子水平的鉴定Fig.3 Molecular identification of T1-T3 transgenic cotton lines PCR detection and qRT-PCR detection

表2 转基因棉花的游离脯氨酸含量及苗期盐胁迫下的盐害指数Tab.2 Free proline content of transgenic cotton and salt damage index in seedling stage under salt stress

2.3.2 T3转基因棉花鉴定T1、T2连续2代游离脯氨酸含量显著高于受体对照R15的7个株系，继续种植收获T3种子，经过对叶片喷草铵膦除草剂抗性鉴定及目的基因进行PCR检测，将植株叶片均抗草铵膦、且PCR检测均为阳性的株系确定为转基因阳性纯合株系，共筛选出6个转基因纯合系（图3）。

T3耐盐鉴定共鉴定6个转基因纯合株系、1个常规耐盐品系（中99807）及1个受体品系（R15），结果如表2所示，转基因株系及中99807盐害指数均低于受体对照R15，其中转基因株系L2、L5、L22、L29的盐害指数显著低于转基因受体对照R15，表明转ST6-40基因棉花株系的耐盐性比受体对照显著提高。与常规耐盐品系中99807相比，有4个转基因品系的盐害指数较低，其中转基因株系ST6-40-L2的盐害指数显著低于中99807。表明转入ST6-40基因能有效提高棉花品种耐盐性。

此外，对盐胁迫下的植株生长情况进行观察，可以看出，在苗期和花铃期转基因棉花植株的生长势、萎蔫程度等方面均优于受体对照品种（图4）。

图4 转基因棉花苗期、花铃期耐盐鉴定Fig.4 Identification of salt tolerance during seedling and bell period of transgenic cotton

3 结论与讨论

近10余年来，我国转基因抗逆棉花品种选育取得了重要进展，挖掘了EDT1等一批能明显提高棉花品种抗旱、耐盐性的基因[10-11]。选育了一批转基因抗旱耐盐棉花新品种，为我国棉花抗逆育种提供了丰富的种质资源。在棉花转基因耐盐育种研究方面，发掘了一批耐盐基因，获得了一些转基因耐盐棉花新材料，主要包括TsVP基因棉花、HcVP基因棉花、TaNHX2基因棉花等，以及拟南芥AtNHX1基因、大豆GmNHX1基因和百脉根LcVP1基因等。应用较多的是与代谢相关的植物转录调控基因，主要包括甜菜碱CMO基因、大肠杆菌的beTA基因和小盐芥ST6-40基因等[12-15]。研究发现，在拟南芥过量表达ST6-40基因，植物根系长度、叶片及株高都有显著提高[16-17]。本研究利用ST6-40基因构建了重组载体pCB2004-ST6-40，采用农杆菌介导法将其转入棉花品种R15，共进行了350个转化事件，转化率为19%，获得65个阳性T0株系，其中再生植株中90%为阳性苗。转化效率及阳性率高于其他转基因棉花，表明我们建立的遗传转化体系高效稳定，经过对叶片喷施草铵膦除草剂抗性鉴定及目的基因进行PCR检测双重筛选阳性植株的方法，确保筛选鉴定出转基因阳性纯合株系。

耐盐鉴定基本采用测定游离脯氨酸、丙二醛等生理指标来鉴定[18-20]，本研究为获得稳定的耐盐转基因棉花，对T1所获得的48个阳性转基因棉花进行游离氨基酸测定，发现34个的含量高于对照，进一步对其T2鉴定，31个的含量高于对照，其中连续2代的游离脯氨酸含量均显著高于对照的是L2、L5、L14、L18、L22、L29共6个株系。此外，利用盐胁迫下棉花植株叶片受损程度来计算盐害指数，该方法能够较客观地反映盐胁迫下棉花植株的生长状况，筛选的的棉花材料在生产上适应性更强[21-22]。本研究对前述6个株系的T3鉴定发现，均为阳性转基因；且盐害指数结果表明，L2、L22、L5、L29均优于中99807，其中L2显著优于中99807，表明转ST6-40基因棉花品系耐盐性较强。因此，鉴定筛选的转基因耐盐品系生产适应性更强[23]。

转基因耐盐育种作为一种高效的棉花耐盐育种手段，本研究通过构建pCB2004-ST6-40重组载体，利用农杆菌介导法将ST6-40基因转入棉花基因组，经耐盐性鉴定，获得耐盐性显著增强的转基因棉花株系，为棉花耐盐育种创制了新的种质材料，加快棉花耐盐育种进程。此外，基于该研究已经申报并获批了ST6-40-2等4个耐盐性表现突出的ST6-40转基因棉花株系的转基因生物安全中间试验，下一步将利用杂交、回交等常规育种技术，进一步改良这些材料的农艺性状和产量性状，为棉花耐盐育种提供优异种质来源。