一种基于荧光探针技术的鸭坦布苏病毒核酸检测方法的建立

郭瑞，付燕峰，娄亚坤，苗银萍，瞿超杰，任宝红

（郑州中道生物技术有限公司 郑州 450000）

鸭坦布苏病毒（duck tembusu virus，DTMUV）是一种可以引起鸭坦布苏病的单链RNA 虫媒病毒，属于黄病毒科（flaviviridae），黄病毒属（flavivirus），恩塔亚病毒群（ntaya virus group）。该病毒最早在1955 年发现于东南亚地区，90 年代传入我国，并在2010 年后，在我国东南部等地区大面积感染鸭类，发病率高达90%，死亡率为5%～30%[1,2]。该病毒传播速度快，感染性强，不分日龄鸭均易感染，导致雏鸭生长缓慢，蛋鸭产蛋下降或停产，给我国养鸭业造成了巨大的经济损失。据不完全统计，鸭坦布苏病毒病仅2010 年造成的经济损失就达数十亿元。此外，还能引起鸡和鹅的感染和发病[3,4]。

DTMUV 病毒具有一个约11kb 的单股正链RNA 基因组，它由一个单独开放阅读框（ORF）组成，两侧分别是5'端和3'端非编码区（UTR）。5'端被一个m7GppAmpN2 结构所覆盖，3'端没有poly A 尾巴[5,6]。ORF 共编码三种结构蛋白：囊膜蛋白（E）、前膜蛋白（prM）和衣壳蛋白（C），以及七种非结构蛋白（NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B 和NS5）。同其他黄病毒一样，DTMUV 的E 蛋白为病毒最大的结构蛋白和主要的抗原蛋白，同时在病毒复制过程中，对病毒吸附、膜融合以及受体结合等方面发挥着至关重要的作用，决定着病毒的细胞嗜性[7,8]。

目前，检测鸭坦布苏病毒的实验室方法主要有病毒分离鉴定、血清学检测、分子生物学检测等。病毒分离鉴定费时费力，不利于快速检测；血清学检测包括有琼脂扩散试验、中和试验、间接免疫荧光等，整体存在敏感性低、特异性弱、操作较困难，不适应于临床快速诊断等缺点；分子生物学检测，荧光探针技术具有特异性强、敏感性高、无毒害、可数据化，同时操作简便、快速、应用广泛，俨然成为主流核酸检测技术。因此，本研究基于荧光探针技术，拟建立一种特异、敏感、稳定的鸭坦布苏病毒核酸检测方法，以推进DTMUV 的早期、快速诊断，为养禽业的健康发展增添技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

1）样品及来源。DTMUV 靶基因质粒pUC57-DTMUV-E，委托华大基因合成；DTMUV WF-100 株，购自齐鲁动物保健品有限公司；DTMUV HB 株，购自瑞普保定生物药业有限公司；DTMUV FX2010-108P 株、鸭瘟病毒（DVEV）和新城疫-I 系（NDV），购自吉林正业生物制品股份有限公司；番鸭呼肠孤CA 株（MDRV），购自青岛易邦生物工程有限公司；鸡传染性法氏囊B87 株（IBD）、鸡传染性喉气管炎（ILTV）和禽流感-H7 亚型（AIV-H7），购自哈尔滨维科生物技术有限公司；健康鸭组织，购自大型生活超市。

2）主要试剂和仪器。核酸提取试剂盒（柱膜法），由郑州中道生物技术有限公司生产；5× Neoscript RT Premix-UNG（ProbeqRT-PCR），购自珠海宝锐生物科技有限公司；Gentier 48E 实时荧光定量PCR 检测系统，购自西安天隆科技有限公司。

1.2 方法

1）引物、探针设计与合成。基于NCBI 收录DTMUV E 基因序列（登陆号KY626659.1），利用DNAman 软件分析比对E 基因的相对保守区域，再结合软件BD 8.0 设计引物和探针（见表1），同步对应的靶序列为靶基因；委托华大基因合成引物、探针、靶基因。

表1 DTMUV引物探针信息

2）鸭坦布苏病毒荧光RT-PCR 核酸检测方法的建立。以鸭坦布苏病毒疫苗WF-100 株为样品，按照核酸提取试剂盒（柱膜法）提取核酸作为阳性核酸模板；对合成质粒pUC57-DTMUV-E 测定浓度，并用TE 缓冲液稀释至107copies/μ L 作为阳性质粒模板；以核酸模板和质粒模板的CT 值最小为原则，对反应程序、引物浓度、探针浓度等条件，采用矩阵法摸索，优化调试以建立鸭坦布苏病毒荧光RT-PCR 核酸检测方法。

3）特异性验证。对DTMUV（WF-100 株、FX2010-108 株、HB株）、DVEV、NDV、MDRV、IBD、ILTV、AIV-H7、健康鸭组织等10 种样品，按照核酸提取试剂盒（柱膜法）提取核酸作为特异性验证核酸模板；使用建立的鸭坦布苏病毒荧光RT-PCR 核酸检测方法，对特异性验证核酸模板进行特异性检测验证。

4）敏感性验证。标准曲线的建立：将合成质粒pUC57-DTMUV-E 用TE 缓冲液10 倍连续梯度稀释，制备107～101copies/μ L 7 个梯度标准浓度模板，同时设立TE 缓冲液为空白对照。

敏感性验证：使用建立的鸭坦布苏病毒荧光RT-PCR 核酸检测方法对标准曲线7 个梯度质粒模板检测，分析该方法敏感性情况。并绘制标准曲线，分析线性关系。

5）重复性验证。使用建立的鸭坦布苏病毒荧光RT-PCR 核酸检测方法，对标准曲线7 个梯度质粒模板，进行3 次重复检测。分别统计分析各梯度的CT 值平均值、标准差（SD）和变异系数（CV，%），验证所建立方法的重复性。

2 结果

2.1 鸭坦布苏病毒荧光RT-PCR 核酸检测方法的建立

本研究经过一系列以鸭坦布苏病毒疫苗WF-100 株阳性核酸和合成基因的阳性质粒为模板，对反应程序、引物浓度、探针浓度等条件优化调试。最终确定鸭坦布苏病毒荧光RT-PCR 核酸检测方法的引物终浓度为500nM，探针终浓度为300nM；反应体系为25μ L，其中模板添加量为5μ L；反应程序为：45℃/15min；95℃/30s；94℃/10s，60℃/30s，40 个循环。

2.2 特异性验证

采用鸭坦布苏病毒荧光RT-PCR 核酸检测方法分别对DVEV、NDV、MDRV、IBD、ILTV、AIV-H7、健康鸭组织等提取核酸样品进行检测，结果显示均为阴性，而对DTMUV 的WF-100 株、FX2010-108 株、HB 株三种疫苗的提取核酸样品检测结果均为阳性。试验结果显示该检测方法与常见禽类病毒核酸无交叉反应，特异性为100%（图1）。

图1 qRT-PCR 检测DTMUV 特异性验证扩增曲线

2.3 敏感性验证

DTMUV 阳性质粒pUC57-DTMUV-E 用TE 缓冲液10 倍连续梯度稀释，制备107～101copies/μ L 的7 个梯度标准浓度，模板检测结果显示，鸭坦布苏病毒荧光RT-PCR 核酸检测方法的敏感性10copies/μ L（见图2）。根据以阳性质粒浓度的对数为X 轴，以Ct值为Y 轴，绘制回归方程，可得到DTMUV qRT-PCR 标准曲线（图3），计算分析相关系数R2=0.9995，回归方程式y=-3.2871x+40.541，扩增效率为99.0%。说明该方法扩增效率高，梯度线性关系良好。

图2 qRT-PCR 检测DTMUV 敏感性验证试验扩增曲线

图3 qRT-PCR 标准曲线

2.4 重复性验证

经过对DTMUV 标准曲线7 个梯度质粒模板（107～101copies/μ L）的三重复检验，计算各梯度平均值、标准差（SD）和变异系数（CV，%），结果显示，该方法各梯度CV 值在0.07%～0.65%区间，整体小于0.5%（见表2）。说明该方法重复性良好，多次检测数据波动小。

表2 qRT-PCR重复性试验结果

3 分析与讨论

鸭坦布苏病毒最早发现于东南亚地区的马来西亚，近年来在东南亚的泰国、马来西亚等地区仍比较流行[9]。从地理传播路线是东南亚至我国东南部，并沿海向北至山东等地。我国与东盟之间的经贸往来正在迅速增长，也暗示着鸭坦布苏病毒可能会在疫情传播中增强，需要我们加强关注。

本研究针对鸭坦布苏病毒E 基因的保守片段设计特异性引物和探针，建立了一种基于荧光探针RT-PCR 技术的核酸检测方法，并对该方法的特异性、敏感性、标准曲线和重复性等进行了充分的分析和验证。结果表明，该方法特异性100%，与家禽常见的新城疫病毒、番鸭呼肠孤病毒、鸭瘟病毒、传染性脑脊髓炎病毒、传染性法氏囊病毒、传染性喉气管炎病毒、禽流感病毒H7 亚型等均无交叉反应。检测敏感性为10copies/μ L；文献显示YAN L等[10]采用的荧光探针法建立的坦布苏病毒敏感性为50copies/μ L，王巧萍等[11]建立的荧光定量RT-PCR 检测方法敏感性为3× 102copies/μ L；对比可见，本法的敏感性优异。同时在曲线的扩增效率为99.0%，标准曲线相关系数为0.9995，且各质粒梯度的重复性CV 值在0.07%～0.65%间，均小于1%，适宜于病原核酸的定量检测分析。

综上所述，本研究针对DTMUV 的E 基因保守序列，基于荧光探针RT-PCR 技术建立的核酸检测方法，在特异性、敏感性、重复性等方面性能良好，可为DMTUV 的临床诊断和流行性病学调查提供一种技术支撑。