菌种培养及保存过程中菌种退化的研究进展

李旻向 刘尔伦 周湘丹 曾光熙

（湖南农业大学生物科学技术学院，湖南长沙 410128）

菌种退化是指菌种在培养或保存的过程中，由于各种因素的影响而引起的某些优良性状劣化的现象，主要是由于自发突变的存在，使遗传物质发生改变，引起有关基因的负突变，从而导致菌种某些优良性状丢失。菌种退化不是瞬间发生的，而是一个由量变到质变的过程，主要发生在传代培养过程中。即使突变发生频率较低，数目基数庞大的菌群中也会出现少量发生突变的个体，并在后续传代培养中突变菌株逐渐取代目的菌株成为优势菌种，影响群体中某产物产量。

1 菌种退化的原因

1.1 自发突变

目前认为造成菌种退化的主要原因是自发突变。自发突变是指由于自然界中各种诱变剂的作用，或由于DNA在复制、修复等过程中碱基配对出现错误而导致有关基因结构发生改变而产生的突变[1]。对于微生物来说，其自身一些特殊的生理特性决定了自发突变频率较其他生物更高。例如：大肠杆菌的代时为20 min，这说明其在一定时间内DNA复制次数远远大于其他真核生物细胞，使其在复制过程中出现错误的概率增大，因而自发突变现象在微生物中的发生频率更高。自然环境中存在大量诱变剂，包括某些化学物质或者宇宙空间中的各种射线。在诱变剂的作用下，DNA结构变得不稳定，更容易发生突变。

化学物质能诱导微生物自发突变，但不是由单一的某种化学物质所导致，而是由多种不明的诱变剂综合作用导致的，这些化学物质通常对微生物有着长期的诱导作用，即便是低剂量，也会对微生物的自发突变产生难以忽视的影响。例如，活性氧簇（ROS）就是一种常见的化学诱变剂，它是一种内源性地引起细胞DNA损伤和老化的物质。ROS能导致几种形态的DNA损伤，包括单链和双链断裂、化学加成、错误交联[2]。ROS中的过氧化氢作为一类细胞代谢产物，是由过氧化氢基团水解产生的。过氧化氢基团又被称为“自由基”，是由生物体内过氧化氢酶催化蛋白质集团生成过氧化氢能对微生物DNA产生损伤作用，当损伤程度较高时，甚至会导致微生物死亡。

空间中存在的宇宙射线也是导致细胞自发突变的原因之一，宇宙射线的辐射作用造成DNA断裂，从而导致DNA结构及稳定性改变，进而造成突变。其中，DNA双链断裂是影响细胞DNA结构的主要DNA链断裂类型，其是一种类型的DNA损伤，是真核生物中最有害的损伤，严重影响基因组完整性[3]，对微生物影响较大。同时，由于其在正常的修复机制下并不能得到修复，因而常常导致一系列问题，甚至导致细胞死亡。

1.2 连续传代

连续传代能导致菌种退化，主要是由于在连续传代的过程中，菌种发生自发突变的频数会增加。传代过程中发生自发突变的概率随着传代次数的增加而增加，尤其是负突变发生概率将大大增加。在连续继代培养后，发酵菌株将经历退化过程，这与其生理等方面有重要关联。例如，Bachmann等将一株乳酸乳球菌株连续传代繁殖1000代，后续通过测序发现，3株传代菌株中分别出现6处、7处和28处突变[4]。另一方面，在多次连续传代的过程中，拥有负突变基因的衰退型细胞会更快地增殖并占据优势地位，从而使整个群体出现相关衰退性状。在工业发酵中用于生产丙酮-丁醇-Tra（ABE）的产溶剂tic梭菌在多次连续传代过程中失去了生产溶剂的能力[5]。经过研究鉴定，对于多次继代培养的平菇来说，其菌丝体中DNA损伤修复系统尤其是同源重组修复的双链断裂受损，从而导致菌株退化[6]。

1.3 培养条件

培养条件对菌种退化的影响巨大，其中，温度、pH值、湿度、通气量等是培养条件的重要衡量指标，氧气、营养、保存温度等是保存条件的衡量指标。在固定其他变量的条件下，可以筛选出某微生物菌种的最佳单一变量。即便对于同种微生物，也可能出现不同表型，而某些表型常被视为退化菌株的特征。例如，食用菌繁殖时通常会分泌多种胞外酶用来分解有机物，如纤维素酶、果胶酶及半纤维素酶等[7]，不合适的培养条件会造成菌种退化，常常表现为长势差、出菇迟、产量下降、质量变差、抗性减弱等[8]；在繁殖阶段也通常出现色素产量增加、子实体扭曲等现象[9-12]。

在菌种筛选工作中，培养基不合适会造成筛选工作困难，短期内极易误认为是保存条件不适宜而导致的菌种退化。若培养基中提供的有机物能直接被微生物利用，那么某些具有特殊有机物降解能力的微生物将不再消耗多余的能量合成降解特殊有机物的酶，乳糖操纵子试验便很好地证明了该观点，这也曾经被学者称为“生物合成的经济学效应”[13]。当然，这与菌种衰退是否具有显著关系还需要进一步试验证明。

已有研究表明，培养基的成分与菌种退化有一定的联系。当培养基成分单一或者缺乏菌种所需的营养成分时，可能导致菌丝生长率下降。例如，当草菇长期在以葡萄糖为主要碳源的培养基上生长时，可能导致其对碳源吸收率降低而加速菌种退化，而通过更换碳源能提高菌丝对碳源的吸收率[14]。另外，培养基中成分构成与菌种代谢活动也有一定的联系。邹芒阁等[15]发现，培养基碳氮比对于药用真菌某些代谢产物多糖产量有一定的影响，并且不同种类的药用真菌最适碳氮比具有明显差异，多糖合成量在不同浓度氮源下随碳源变化而出现不同变化趋势。但是，培养基碳氮比并不是对所有的菌种代谢活动都具有显著影响。诸发会等[16]发现，利用茯苓菌株作为试验菌种，在不同碳氮比浓度水平的处理下，各组茯苓菌株子实体形成无显著差异。培养基成分以及培养条件优化能较大程度地提高微生物对营养物质的利用率、提高菌种活力、延缓菌种退化，而不同的微生物种类对营养物质的需求不同，所采用的培养基配方也各不相同。因此，培养基配方在延缓菌株衰退的科研工作中有重要意义。

1.4 杂菌污染导致基因重组

在培养过程中，由于培养条件不良或者操作条件不严格而导致杂菌污染，也会出现菌种退化风险。因为一旦出现杂菌污染并且在培养基中出现杂菌菌落，就有可能导致杂菌细胞部分片段的DNA被所筛选目的菌吸收，进而导致转化现象，有可能会改变所筛选菌种的基因型，若被整合的片段涉及相关酶合成基因，菌种便会发生一定程度的衰退。然而，杂菌污染导致菌株生活力下降并不意味着菌种一定发生了退化，当杂菌数大量增加时，会占据有利空间和营养物质，从而导致目的菌数下降，这与真正的菌种退化有一定的区别，通过划线分离的方法一般可以检验产量下降是否是由于杂菌污染[17]导致的。

1.5 噬菌体感染导致菌种退化

大量研究表明，噬菌体侵染也能导致菌种退化。以潜伏感染为主要特征的病毒颗粒进入宿主细胞后，噬菌体的遗传物质会整合至宿主DNA上以缓慢的增殖速度存在于宿主细胞，在此过程中有可能导致宿主细胞相关酶基因或相关化学物质合成基因替换或者失活，从而导致菌种退化。另外一种情况便是在某种特定遗传或者生态环境条件变化下，宿主细胞内的病毒颗粒复制骤增[18]，病毒颗粒数目通过爆炸式增长并在宿主细胞中失控表达而导致宿主细胞生活力下降。对于某些食用菌来说，菌丝生长明显受阻，长势下降，表现为菌丝体退化等明显特征；对于纤维素、木质素分解菌来说，会出现产酶量低、菌落少而暗淡、活性差等一系列特征。

1.6 核型改变导致菌种退化

某些食用菌在生长过程中会产生菌种异核现象，而核型改变可导致菌种遗传变异的发生，出现菌种退化现象[19]。具有不同遗传性的核共存于同一细胞，极有可能导致遗传性状改变。另外，某些真菌如香菇具有特殊的生殖方式，即四极性异宗结合。这样的结合方式使相同极性的孢子结合不可育，不能发育形成子实体，这一类菌丝最后将形成单核体，造成菌种退化[20]。

2 预防、延缓菌种退化的措施

菌种退化是遗传因素与环境因素的综合作用而产生的结果，对菌种退化现象的预防措施不能仅从单方面进行分析、考量，应综合考虑展开。

2.1 创造科学的保存条件

引起菌种退化的外界环境因素众多，其中温度是最主要的影响因素，其作用原理是通过控制细胞内生化反应速率，从而对细胞代谢产生影响。细胞在代谢旺盛时，繁殖速率相应提高，其过程中出现的突变也会相应增多。例如，在大肠杆菌营养缺陷型中，温度升高会导致其突变率显著提高。因此，通过控制温度能降低菌种退化概率，据此衍生出的最有效的技术便是菌种保存技术，目前国内外公认防止菌种退化的最好办法是采用液态氮超低温保存[21]，而短暂保存时通常采用低温保存，但低温保存时间不宜过长。

在现有低温保存技术下，通过加入各类辅助试剂被证明有更好的保存效果。例如，以甘油、海藻酸钠和二甲基亚砜为低温保护剂，采用真空冷冻干燥法制备厌氧氨氧化菌粉对于厌氧氨氧化菌的复壮效果最佳[22]，以半固体穿刺保存法保存工程大肠杆菌能达到1年左右的保存时间，对于某些菌种时间则更长[23]。以载体法对硝化细菌进行保存时，加入亚硝酸盐有着更好的效果，此外还有空气阻隔法、避光法等[24]。朱华玲等发现以0.1%PEG-6000水溶液保存法对多种真姬菇菌的保藏效果最佳[25]。周龙洋等研究不同保藏方法对66种真菌的保存效果，结果表明，对于短期保藏需求，斜面移植法效果较好；对于长期保存需求，液状石蜡保存法及白胶塞封口法有更好的效果[26]。

2.2 菌种复壮

对于已经出现退化的菌种，可通过菌种复壮方法，及时分离正常菌株并对其纯化，避免退化菌株占据优势而使整批菌种完全退化。王殿振等[27]利用菌种北虫草为试验材料，进行多次传代培养得到目的退化菌种，采用多种复壮方法诸如蚕蛹回接法、孢子分离法、组织分离复壮法等进行菌种复壮，通过对比经复壮后菌种与未经复壮菌种菌丝日均生产量，发现在各种菌种复壮方法中以蚕蛹回接法效果最佳。夏淑春等[28]利用蛹虫草菌种为试验材料，分别采用基内菌丝分离法、分生孢子分离法、子囊孢子分离法等进行菌种复壮，对比各种复壮方法下菌丝生长量，发现子囊孢子分离法和蚕蛹回接法复壮效果显著优于分生孢子分离法。孔梓璇等[29]利用草菇作为试验材料，通过添加外源氨基酸对菌株进行培养，以探究外源氨基酸的潜在复壮作用，发现培养基中添加外源丝氨酸可显著降低菌株中活性氧含量。

2.3 防止杂菌污染

对于菌种退化的预防不能仅从菌种考虑，对于外在环境的严格控制在众多的科学研究及发酵生产中被证明更具科学性及可行性。在发酵工业中，外源污染是对菌种影响较大的重要因素之一，这也是导致工业发酵菌种目的产物产量降低的重要因素，包括杂菌污染导致发酵菌株优势地位被杂菌取代造成产量下降以及噬菌体感染菌株导致菌株衰退而影响产量。对于噬菌体感染的防治在近年来得到了一定的突破。张高娜等[30]研究发现，对于噬菌体增殖感染发酵菌现象的预防，添加0.5%草酸或0.5%柠檬酸具有较好的效果。另外，选育抗噬菌体的优良菌株对于解决噬菌体感染也有积极意义。抗噬菌体选育有多种方法，其中通过自然诱变的方式得到优良菌株已被多次报道[31]。对于杂菌污染的防治，在发酵、食品工业中早已形成完善的措施体系。例如，在食用香菇培育过程中，一般通过选育优良菌种和严格无菌操作实现杂菌污染防治。在选育优良菌种方面，通常选育具有菌丝旺盛、色泽洁白等特征的菌种；在严格无菌操作过程中，利用高锰酸钾与甲醛以1∶2混合后对操作空间进行消毒杀菌在多年的菌株生产中被证明是极为有效的[32]。

3 结语

目前，对于菌种退化的预防及延缓，人们提出了各种合理的方法措施，但主要围绕环境因素切入，并且更多体现在工业发酵、食品工业等与人类生活息息相关的方面。然而，由自发突变导致的退化问题目前仍然没有比较好的解决方案，仅提出了一些相关建议，如利用某些代谢过程抑制剂如SOS阻断剂等阻断相关反应，利用基因工程的方法对微生物性状进行改良并保证其稳定性。但是，在微生物生理代谢机制及菌种退化控制方法等新技术上的研究甚少。总之，目前对于菌种退化的研究仍然是有限的，需要众多的科研工作者不懈努力，最终改善甚至解决菌种退化问题。