鲍曼不动杆菌群体感应抑制剂与生物膜形成的研究进展

成婷婷，冯 媛，王崇刚

鲍曼不动杆菌是一种非乳糖发酵、专性需氧的革兰阴性杆菌，是医院常见的条件致病菌之一。鲍曼不动杆菌耐药机制复杂，且多种耐药机制并存，造成较高的耐药率，生物膜形成是鲍曼不动杆菌耐药的重要机制之一。生物膜是细菌依附于各种生物与非生物表面由自身产生胞外多糖、基质蛋白和胞外 DNA 等大分子物质的一种高度结构化的膜状复合物。群体感应系统（QS）在鲍曼不动杆菌中参与生物膜形成，还通过调控耐药基因表达来影响生物膜的耐药。因此，干扰QS 信号或可成为人类对抗细菌感染和攻克耐药问题的新靶点[1]。本文主要介绍鲍曼不动杆菌生物膜形成过程、耐药原因及群体感应的最新进展，为群体感应抑制剂（QSI）的研发提供新思路。

1 生物膜形成过程

生物膜形成过程包括细菌黏附、形成微菌落、早期结构形成、成熟生物膜形成、生物膜内细胞的释放等过程[2]。整个形成过程受到许多因素调控：①CsuA/BABCDE 伴侣蛋白分泌系统和BfmRS 调控系统分别产生和调节菌毛形成和介导初始黏附；②表面黏附蛋白 Bap 参与生物膜起始黏附，促进生物膜成熟；③OmpA 参与生物表面生物膜形成，介导鲍曼不动杆菌对人上皮细胞的黏附；④O-连接蛋白糖基化系统能提高细菌生物膜形成能力，促进细菌的初始附着并增强成熟生物膜的质量和密度；⑤QS 通过感应细胞密度产生QS 信号分子，进而影响细胞群密度和生物膜形成[3]。

2 群体感应在生物膜形成中的调控作用

2.1 群体感应

QS 是细菌自身群体密度信号感应系统，是细菌自身分泌自诱导信号分子相互沟通的过程。细菌细胞间相互交流，产生小的、可扩散的、类似激素的分子，产生信号分子N 酰基高丝氨酸内酯（AHL，自诱导剂分子），可用于监测种群密度[4]。信号分子感受细菌群体密度，调控相应基因表达，改变细菌生存方式，自诱导剂特异性地与转录调节因子结合，进而调控毒力因子、生物膜形成和代谢产物的产生等过程。QS 通过有效的细胞间通讯，使种群在一个更好的环境中生存和繁殖[5]。

2.2 群体感应分子

在费氏弧菌中发现了第一个自诱导剂及其同源调控系统，该系统由两个LuxI 和LuxR 蛋白家族的蛋白组成。由LuxI 合成的自诱导剂直接与LuxR 蛋白相互作用，该复合物结合到luxe-box 启动子的特定顺式作用序列上，从而调控QS 靶基因的表达。由于LuxI 的表达也被AHL 结合的LuxR激活，一旦QS 被激活，就会诱导产生自诱导剂，使周围环境充满信号分子。这种正反馈回路是QS的标志[6]。费氏弧菌的LuxI/LuxR 调控系统被认为是革兰阴性菌QS 基因的调控模式。鲍曼不动杆菌的QS 机制由一个与革兰阴性菌中典型的LuxI/LuxR 系统同源的双组分系统AbaI/AbaR 介导[7]。鲍曼不动杆菌QS 主要由AbaI（信号分子合成酶）、AbaR（转录调节蛋白）以及 AHL 3 个组分构成。信号分子合成酶AbaI 是催化合成群体感应信号分子AHL 的胞内酶，催化酰基载体蛋白上的酰基侧链与 S-腺苷甲硫氨酸的高丝氨酸基团结合，合成酰基化的AHL。AbaR 是群体感应信号分子 AHL的受体，同时也是群体感应的转录调节蛋白。当环境中AHL 水平低于阈值水平时，信号无法被检测，此时细菌不断生长繁殖从而使AHL 不断积累，直到环境中的 AHL 浓度达到能被检测的阈值水平，此时细胞内的 AHL 转运到其受体蛋白（AbaR）并与之结合，激活了AbaR 的转录调节功能，引起相关基因表达的全局性变化[8]。

2.3 群体感应与生物膜形成

鲍曼不动杆菌分泌自诱导分子AHL 进行信息交流，引起聚集，促进鲍曼不动杆菌从浮游状态向生物膜转化，主要作用于生物膜形成的中、后期[9]。已发现6 种以上AHL，以含C10 或C12 酰基的AHL 最常见，63%不动杆菌属细菌至少分泌1 种AHL[10]。AbaI是细菌群体密度调控基因，AbaI失活，生物膜形成减少30%～40%。QS 在耐药中起重要作用的途径还包括上调生物膜相关的胞外基质（EPS）和外排泵基因，外排泵AdeFGH可增加生物膜中AHL 分子的转运[11]。当AHL 分子水平达到阈值，细菌QS 被激活，细菌不断分泌大量EPS，从而形成生物膜，可阻碍抗菌药物的渗透作用，产生耐药性；呈高密度状态的细菌在感应系统的调控下毒力陡升，同时抑制宿主的免疫系统[12-13]。大量研究表明，鲍曼不动杆菌群体感应与其运动性、抗生素抗性、生存特性和生物膜形成有关[14]。抑制 QS 能够抑制细菌生物膜形成[15]，增加抗菌药物敏感性[16]等。

3 抑制群体感应的有效途径

QS 信号机制的破坏称为群体猝灭，基于细菌QS 的调控原理，产生了QSI。QSI 通过如下机制发挥作用：①通过干扰合酶抑制信号分子的合成；②破坏细菌信号分子及预防信号分子积累；③阻断相互作用受体；④作用于AHL 本身的群体猝灭策略。当前已有研究应用 QSI 降低细菌毒力，在费氏弧菌、哈氏弧菌、霍乱弧菌、铜绿假单胞菌和大肠埃希菌等致命病原体中，已有报道应用 QSI抑制细菌的QS，抑制细菌毒力因子，但不干扰细菌生长，从而控制这些病原微生物的感染。针对鲍曼不动杆菌已经提出了许多群体猝灭策略。近年来，提出了许多天然或合成的QSI。这些抑制剂是QS 的小分子调节剂，这些调节剂可以是AHL类似物（非天然AHL）、受体抑制剂或来自天然产物或合成分子的合酶抑制剂等[17]。以下将分别阐述4 种群体感应抑制途径。

3.1 针对AHL 合酶

AHL 合酶负责合成信号分子AHL。鲍曼不动杆菌中产生AHL 的酶是AbaI 合成酶，AHL 与细胞表面受体分子结合，启动QS 过程。以AHL 合酶为靶点是一种有效的群体猝灭策略。当合成酶被抑制时，信号分子不能合成，QS 机制停止。此外，这也可能干扰细胞的毒性机制[18]。

3.2 针对AHL 信号分子

AHL 信号分子是由LuxI 家族将脂肪酸酰基衍生物转移到sadenoyl-methionine（SAM）的氨基上形成的。鉴于此反应的性质和所涉及的前体，可以使用SAM 或脂肪酸生物合成抑制剂作为AHL 的QSI，如sadenosyl-同型半胱氨酸（SAH）、sinefungin、5-甲基硫腺苷、各种SAM 类似物和SAM 生物合成抑制剂环亮氨酸均可抑制AHL 的产生。阿奇霉素干扰铜绿假单胞菌中C4-高丝氨酸内酯（C4-HSL）和3-oxo-C12-HSL 的合成，从而减少细菌对聚苯乙烯表面的黏附。此外，在慢性肺部铜绿假单胞菌感染的小鼠模型中，阿奇霉素治疗可显著改善生物膜的清除[19-20]。在鲍曼不动杆菌中，最常见的是C10 或C12 酰基链的长链AHL，最近发现了一种群体猝灭酶MomL，Zhang等[21]证实该酶能有效降解各种革兰阴性菌的不同AHL 信号分子。MomL 是AHL 内酯酶，通过内酯水解催化AHL 降解，MomL 在降低鲍曼不动杆菌LMG10531 生物膜形成的同时，还能增加鲍曼不动杆菌对不同抗生素的敏感性。

3.3 针对靶向受体

研究证实了不饱和脂肪酸棕榈烯酸（PoA）和霉烯酸（MoA）作为生物膜化合物对鲍曼不动杆菌QS 的影响，这些不饱和脂肪酸在亚抑菌浓度（0.01、0.02 和0.05 mg/L）可以抑制鲍曼不动杆菌ATCC 17978 的运动和生物膜的形成[22]。结果表明，PoA 比MoA 具有更好的抗生物膜作用。这些脂肪酸降低了调节因子AbaR 的表达，减少了AHL 合成，通过降低调节基因表达或通过调节AbaR 活性调节靶向受体，最终都会导致AHL 的低效结合，从而抑制QS[23]，而且外源AHL 的加入可以扭转这一效应[21]。

3.4 天然产物或合成分子的合酶抑制剂

目前已知植物提取物如乙酸乙酯等具有明显的抑制QS 活性作用，但尚未完全阐明植物化学物质的确切作用方式[24]。许多天然和合成化合物已被发现可抑制QS[25]，与AHL 结构类似的呋喃酮C-30 可与QS 受体结合，呋喃酮C-30 作为QSI，能够抑制鲍曼不动杆菌ATCC 19606 菌毛编码和调节基因表达以及菌毛和生物膜的形成。呋喃酮C-30不影响细菌存活，抗生素与呋喃酮C-30 可以发挥协同作用，虽然已有多项研究表明呋喃酮对生物膜具有QS 抑制作用，但在临床治疗中这些化合物的毒性可能限制其使用[26-27]。

此外，有研究证实QS 信号主要是一些可扩散的小信号分子，包括醇脱氢酶家族（ADH）[28]。针对ADH 抑制剂双硫素和激活剂牛磺酸的研究进一步证明，ADH 在鲍曼不动杆菌的生物膜生长行为中起着重要的调控作用，双硫脲抑制ADH 活性和牛磺酸增强ADH 活性可分别降低和增加鲍曼不动杆菌生物膜的形成、生长和运动。由此可见，ADH 在鲍曼不动杆菌的生物膜生长行为中起着重要的调控作用。针对ADH 进行更深入的探索有助于为制定鲍曼不动杆菌感染的治疗方案提供新思路。

4 QSI 的优点与不确定性

QSI 通过抑制细菌QS 抑制毒力因子和生物膜的形成，较传统抗生素具有以下优点：①QSI 不妨碍细菌生长和必需蛋白质合成，研究证实AbaI缺乏不会影响细菌存活，但能降低EPS 含量、抑制毒素产生，不利于成熟生物膜的形成，同时避免杀死有益菌；②QSI 作用缓慢，可避免细菌死亡后释放大量脂多糖引起败血症；③QSI 与抗生素联合具有协同作用，QSI 可以增强致病菌对抗生素的敏感性，减少抗生素的使用剂量，防止诱导产生耐药菌，尤其适合治疗耐药革兰阴性菌引发的感染[1]。因此，干扰QS 被认为是一种很有前景的对抗细菌感染的策略，通过抑制细菌毒力，从而影响病原体致病的能力，而不是影响其生长，不施加选择压力，有助于避免耐药性出现[29]。QSI较传统抗生素具有以下不确定性：①不确定哪些参数会影响QSI 的发生和基因表达的后续模式；②不确定QS 的诱导会影响生物膜群落的致病潜力，还是改变生物膜的抗菌耐受性，不确定QSI在生物膜群落中的功能后果。

5 结语与展望

生物膜相关感染难清除，也更容易引起复发。找到有针对性的控制和治疗措施，是实际抗感染工作急需解决的问题。QSI 可能成为优良的辅助药物，如果在治疗中较早使用，则会延迟甚至消除耐药性。这将有助于设计辅助药物疗法，如将抗生素和其他具有QSI 效应的物质联用可以发挥协同作用，以减少药物的剂量和不良反应、延缓细菌耐药速度。需要进一步研究QSI 在生物膜形成、维持和扩散中的作用，并在实际应用前开发出无毒、活性更强的QSI。QSI 已被证明是一种很有前景的抗菌膜制剂，在未来治疗细菌感染方面有很大的价值。