卵清蛋白-阿拉伯胶聚电解质复合物纳米颗粒的制备与表征

邵家起，李康昱，肖军霞，仇宏伟

(1. 青岛农业大学食品科学与工程学院，山东青岛 266109；2. 青岛农业大学学报编辑部，山东青岛 266109)

在一定条件下，两种带相反电荷的聚电解质之间相互作用能够形成聚电解质复合物。聚电解质相互作用所形成的复合物沉淀可以显著提高物质的黏性与界面弹性，但因相互作用过程中通常还伴有疏水相互作用、氢键、范德华力等非共价相互作用力，导致反应过程复杂，并受pH值、温度、混合比例、离子强度等诸多因素影响[1]。据报道，聚电解质复合物在微囊化、Pickering乳液制备、可食性薄膜制备和药物靶向递送等方面均有广泛应用[2-3]。在这些报道中，与传统的复凝聚法制备微胶囊的方式相比，用聚电解质复合物制备Pickering乳液可以更好地解决常规乳化剂乳化能力低的问题。特别是近几年，蛋白质-多糖复合物作为最具潜力的有机Pickering乳液稳定剂得到越来越多人的关注[4]。卵清蛋白-海藻酸钠复合物、壳聚糖-阿拉伯胶复合物、乳清分离蛋白-果胶复合物已被证明具备稳定Pickering乳液的能力[5-7]，蛋白质-多糖复合物的稳定性、流变学性质、内部结构等因素对Pickering乳液的稳定性起着关键作用。

卵清蛋白(ovalbumin，OVA)是鸡蛋清的主要蛋白成分，约占鸡蛋清质量的65%，分子量44.5 kDa，等电点约4.5，是一种由386个氨基酸组成的球状蛋白[8]。由于OVA来源广泛，是食品工业中常用的一种乳化剂。阿拉伯胶(gum arabic，GA)提取于金合欢树的渗出物，带负电荷，是一种呈中性或微酸性且混有钙、镁、钾等阳离子的支链杂多糖，具有较高的水溶性、较低的黏度，在水中的溶解度可达50%[9]。由于GA具有乳化、增稠、粘合、起泡等功能性质，常被用于炼乳、口香糖、冰淇淋、糖浆等食品配方中。

聚电解质相互作用是两种带相反电荷聚电解质在静电相互作用下发生相分离而产生沉淀的现象。目前已有关于OVA-GA聚电解质相互作用的报道：Niu等[10]首先观察到OVA与GA在一定条件下共存时可以形成可溶性复合物，也可发生相分离并生成不可溶性复合物；随后，他所在团队发现在总生物聚合物浓度为6 g/L、pH=7.0时，OVA与GA间的静电相互作用对复合物稳定的常规乳液的pH稳定性不利[11]。但目前关于利用OVA和GA的相互作用制备聚电解质复合物纳米颗粒并用来稳定Pickering乳液的研究暂未见报道。

为探究OVA-GA聚电解质复合物纳米颗粒稳定Pickering乳液的能力，本文研究了OVA与GA质量比、温度、离子强度、静置时间等条件对OVA与GA相互作用的影响，确定形成OVA-GA聚电解质复合物的最适条件，观察复合物静置不同时间后的外观和浊度变化，通过检测复合物粒径和ζ电势来评价复合物的稳定性，利用光学法微流变仪研究复合物的黏弹性，以探讨复合物的界面性质。本文研究结果可为OVA-GA聚电解质复合物纳米颗粒应用于稳定O/W型Pickering乳液提供理论基础。

1 材料和方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

OVA，生物试剂，购自上海瑞永生物科技有限公司；GA，生物试剂，购自国药集团化学试剂有限公司；紫苏籽油，食品级试剂，购自河南家丰植物油有限公司；其他试剂均购自上海国药集团化学试剂有限公司。

1.1.2 仪器与设备

UV-2000紫外可见分光光度计，尤尼柯(上海)仪器有限公司；FDU-1200冷冻干燥机，上海爱朗仪器有限公司；Nano ZS90马尔文动态光散射仪，英国马尔文仪器有限公司；DSA100光学接触角测定仪，德国KRÜSS公司；Rheolaser Master光学法微流变仪，法国Formulaction仪器公司。

1.2 方法

1.2.1 OVA-GA复合物制备条件的优化

分别称取一定量OVA和GA粉末溶解于去离子水中，室温磁力搅拌8 h至完全溶解，配制1 g/L的OVA溶液和GA溶液。作者前期的研究表明，OVA与GA形成复合物的最适pH值为3.5，因此，混合前使用0.1 mol/L HCl溶液分别调节OVA溶液和GA溶液的pH值至3.5。参考Zhang等[12]的方法，将OVA与GA溶液按一定体积混合，使两者的质量比分别达到4∶1、3∶1、2∶1、3∶2、1∶1、2∶3、1∶2、1∶3或1∶4，添加一定浓度的NaCl溶液，使NaCl浓度分别达到0 mmol/L、25 mmol/L、50 mmol/L、75 mmol/L、100 mmol/L，然后在25 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃或80 ℃不同温度下反应20 min，即得OVA-GA聚电解质复合物。用数码相机拍摄反应体系的外观，用紫外可见分光光度计测定复合物溶液在波长600 nm处吸光值(OD600值)。

1.2.2 OVA-GA聚电解质复合物的表征

1.2.2.1 稳定性的测定

将在最适条件下制备的OVA-GA聚电解质复合物悬浮液静置0 min、1 min、3 min、5 min、10 min，观察外观，测定OD600值，并使用马尔文动态光散射仪测定复合物的粒径和ζ电势。

1.2.2.2 黏弹性的测定

取4 mL在最适条件下新制备的OVA-GA聚电解质复合物溶液，排净气泡，添加到光学法微流变仪样品瓶后立即放入样品室中。设定测量时间700 s，测量温度25 ℃，测量模式Gelation。利用软件Rheolaser Master 1.4.0.0计算复合物溶液弹性指数和宏观黏度指数。

1.2.2.3 三相接触角的测定

参考Wang等[13]的方法并稍作修改。将OVA-GA聚电解质复合物溶液在25 ℃以6 000 r/min转速离心10 min，取沉淀冻干。使用红外压片机将冻干粉末压制成厚度1 mm、直径10 mm的光滑薄片后，浸入盛有紫苏籽油的方形透明玻璃器皿中。使用高精度注射器将2 μL去离子水滴加在薄片表面，平衡后，使用高速摄像机拍摄液滴图像，并利用LaPlace-Young方程拟合液滴轮廓，计算三相接触角。

1.2.2.4 界面张力的测定

使用光学接触角测量仪，采用悬滴法测定OVA-GA聚电解质复合物溶液与紫苏籽油之间的界面张力。当1滴OVA-GA聚电解质复合物溶液从注射器尖端浸入到方形透明玻璃器皿上的紫苏籽油中时，形成油水界面。基于轴对称液滴形状分析，采用LaPlace-Young方程拟合并计算界面张力。

1.3 数据处理

所有试验均重复3次，数据以“平均值±标准误差”形式表示。利用软件SPSS Statistics 25的单因素方差分析法评估平均值之间的差异，P<0.05表示存在显著性差异。利用软件Origin 2019和软件Visio 2019进行图表绘制。

2 结果与讨论

2.1 OVA与GA质量比对OVA-GA复合物形成的影响

由图1可知，OVA与GA质量比对两者混合溶液的分散状态有重要影响。OVA与GA质量比分别为4∶1、3∶1、2∶1时，OVA-GA复合物溶液在静置后逐渐由浑浊变为澄清，静置20 min时，样品瓶底部出现大量有较高黏度的沉淀。OVA与GA质量比为3∶2时，反应体系有部分沉淀生成，浊度仍然较高，说明还有大量的复合物处于悬浮状态。OVA与GA质量比为1∶1或2∶3时，反应体系稳定，复合物颗粒处于悬浮状态，这与Niu等[10]的研究结果一致。由图1还可以看出，随着反应体系中GA占比的升高，溶液浊度呈现先升高后降低的趋势，在OVA与GA质量比为3∶2时溶液浊度升至最大，而在OVA与GA质量比为1∶2、1∶3、1∶4时溶液浊度几乎降为0。溶液浊度的变化与复合物外观的变化相对应，这说明当体系中的GA达到饱和后，过量的GA抑制了OVA与GA相互作用，这与豌豆分离蛋白-壳聚糖复合物溶液的浊度随壳聚糖浓度的升高而降低的趋势一致[14]。因此，选择OVA与GA质量比为1∶1和3∶2的体系进行后续研究。

图1 OVA与GA质量比对OVA-GA复合物外观(A)和

2.2 温度对OVA-GA复合物形成的影响

OVA与GA质量比为3∶2和1∶1时，温度对OVA-GA聚电解质复合物的影响结果见图2。温度从25 ℃升至50 ℃，2个质量比条件下制备的OVA-GA聚电解质复合物的外观与溶液浊度均没有显著变化，但随着温度的进一步升高，复合物溶液的浊度均略有升高。Zhang等[12]在研究OVA和高甲氧基果胶的相互作用时也观察到类似现象：25 ℃和35 ℃ 2个温度条件下，OVA-高甲氧基果胶复合物溶液的浊度差异不显著，但随着温度继续升高，差异显著增加，75 ℃时浊度达到最大。除静电相互作用之外，OVA与GA之间还有疏水相互作用、范德华力和氢键等。通常疏水相互作用需要较高的温度，因此，温度升高到80 ℃时OVA-GA复合物溶液浊度增加，可能是因为OVA与GA之间的疏水相互作用增强。此外，高温会引起OVA热变性：Zou等[15]的研究结果显示，OVA在60 ℃时开始变性，变性温度为81.92 ℃。热变性会引起蛋白质折叠结构的改变以及疏水基团的暴露，从而降低OVA的溶解度[16]，这也可能影响复合物溶液的浊度。综上所述，考虑到高温下OVA蛋白可能发生变性，后续试验选择在25 ℃条件下进行。

图2 温度对OVA-GA复合物外观(A)和

2.3 离子强度对OVA-GA复合物形成的影响

由图3可知，OVA与GA质量比为3∶2和1∶1时，随着NaCl浓度的增加，复合物溶液外观逐渐澄清，浊度减小，这是因为体系中的盐离子对蛋白质和多糖分子上的电荷产生屏蔽作用，明显影响了聚电解质复合物的形成[17]。这一结果可证实静电相互作用是OVA和GA之间的主要作用。此外，该结果还与Ru等[18]在牛血清白蛋白-果胶复合物体系中观察到的结果一致：在与带负电荷的果胶相互作用时，随着盐离子浓度的增加，牛血清白蛋白携带的正电荷越多，它与果胶形成复合物的趋势就越弱。综上所述，盐离子的存在能抑制OVA和GA之间的相互作用，后续试验不再添加NaCl。

图3 离子强度对OVA-GA复合物外观(A)和

2.4 OVA-GA复合物的贮藏稳定性分析

图4为静置0～20 min，OVA-GA聚电解质复合物溶液的外观、浊度、粒径、ζ电势的变化结果。由图4A、图4B可知，随着静置时间的延长，OVA与GA质量比为3∶2的复合物溶液浊度呈逐渐下降趋势，静置10 min时稳定。这与孙燕婷等[19]的研究结果一致。由图4C、图4D可知，随着静置时间的延长，OVA与GA质量比为3∶2的复合物粒径逐渐增大，ζ电势的绝对值逐渐减小。这说明复合物正在不断聚集，且在静置10 min后达到饱和。而OVA与GA质量比为1∶1的复合物溶液外观、浊度、粒径和ζ电势在静置20 min内均没有显著性变化，说明OVA与GA质量比为1∶1时体系较为稳定。这是因为OVA与GA质量比为1∶1时，体系的ζ电势绝对值较高，粒子间的静电斥力较大，不易发生聚集。另外，OVA与GA质量比为1∶1时，聚电解质相互作用程度较低，体系中生成的OVA-GA复合物较少。根据图4C，OVA与GA质量比为1∶1的复合物粒径为367 nm，远低于质量比为3∶2的复合物粒径(1 067 nm)，而粒径较小的复合物可以增加颗粒在油水界面吸附的比表面积，稳定Pickering乳液的能力更强[20]。

图4 静置时间对OVA-GA复合物外观(A)、浊度(B)、粒径(C)、ζ电势(D)的影响

2.5 黏弹性分析

与传统的剪切流变学技术相比，光学法微流变技术可以在保持胶体体系静止状态时，通过测量复合物弹性指数和宏观黏度指数来表征和量化复合物的微观弹性和表观黏度[21]。根据OVA与GA质量比为1∶1和3∶2时复合物弹性指数和宏观黏度指数的测量结果(图5)可知，复合物的弹性指数远高于OVA或GA的弹性指数，表明OVA与GA之间的相互作用有助于提高复合物的微观弹性。Li等[22]也发现了类似现象。此外，相较于质量比为3∶2的OVA-GA聚电解质复合物，质量比为1∶1的复合物具有更高的弹性指数，说明复合物具有更突出的固体属性。这种现象可能与复合物的组成和结构有关：多糖占比较大时，颗粒表面会形成较厚的界面层，阻止复合物颗粒聚集。这有助于复合物稳定Pickering乳液并形成更致密的弹性界面。

由图5还可以看出，OVA-GA聚电解质复合物溶液的黏度高于OVA或GA溶液的黏度。这是因为OVA与GA的相互作用形成一种具有凝胶性质的网状结构[21]。另外，OVA与GA质量比为3∶2的OVA-GA聚电解质复合物的黏度更高，而且随着时间的延长，复合物黏度还会进一步升高，这是因为OVA与GA质量比为3∶2时，体系的相互作用较强，且这种相互作用能使复合物发生聚集，形成更加致密的凝胶网络。

图5 弹性指数(A)和宏观黏度指数(B)

2.6 三相接触角分析

三相接触角可以反映固体颗粒的亲水性和疏水性，三相接触角接近90°，表明固体颗粒稳定Pickering乳液的能力较强。由图6可知，OVA与GA质量比为1∶1和3∶2的复合物三相接触角均小于90°，说明复合物具有稳定O/W型Pickering乳液的能力。其中质量比为1∶1的复合物接触角(81.3°)远大于质量比为3∶2的复合物，说明质量比为1∶1的复合物稳定Pickering乳液的能力更强。另外，OVA与GA质量比为1∶1的复合物的三相接触角大于杏仁胶-乳清蛋白复合物的(58°)[23]，大于乳清蛋白-低甲氧基果胶复合物的(59.8°)[24]，大于花生多糖-蛋白质复合物的(65.1°)[25]。因此，质量比为1∶1的OVA-GA聚电解质复合物具有稳定Pickering乳液的潜力。

A. OVA；B. GA；C. OVA与GA质量比1∶1；D. OVA与GA质量比3∶2。

2.7 界面张力分析

OVA-GA复合物溶液与油相之间的界面张力可以反映复合物制备Pickering乳液的稳定性。根据不可逆吸附理论，固体颗粒分散体系与油滴之间的界面张力越大，形成的Pickering乳液破乳所需的解析能越大，即Pickering乳液越稳定[26]。由图7可知，与OVA溶液或GA溶液相比，OVA-GA复合物溶液与油滴之间的界面张力较大，说明固体颗粒的形成加剧了油滴的收缩。OVA与GA的质量比对体系与油滴之间的界面张力有显著影响，质量比为1∶1时复合物溶液与油滴之间的界面张力更大，这进一步说明OVA与GA质量比为1∶1的复合物更适合作为Pickering乳液的乳化剂，这与Zhou等[27]的结论一致，即玉米醇溶蛋白和果胶之间的相互作用影响玉米醇溶蛋白-果胶复合物颗粒在界面的吸附行为和界面结构的形成。

A. OVA；B. GA；C. OVA与GA质量比1∶1；D. OVA与GA质量比3∶2。

3 结论

探究了OVA与GA相互作用规律，并对制备的OVA-GA聚电解质复合物纳米颗粒的稳定性、黏弹性和界面性质进行了表征。结果表明，OVA与GA的静电相互作用有效提高了OVA或GA的黏弹性和乳化能力。OVA与GA质量比为3∶2的体系具有更强的相互作用，而OVA与GA质量比为1∶1时能形成聚电解质复合物纳米颗粒，具备更高的弹性和更大的界面张力，三相接触角接近90°，能构成更稳定的OVA-GA体系，稳定Pickering乳液的能力更强。因此，OVA-GA聚电解质复合物纳米颗粒是一种有潜力的Pickering乳液稳定剂，研究结果为开发新型食品基料、拓展OVA的应用领域开辟了新途径。