基于网络药理学探究“CRPC治疗方”治疗CRPC的作用机制

李爱玉 张志明 宋忠阳 朱 鹏 徐 倩 李高勤

1.甘肃中医药大学中医临床学院，甘肃兰州 730000；2.甘肃省中医院肿瘤科，甘肃兰州 730000；3.甘肃中医药大学附属医院肿瘤科，甘肃兰州 730000；4.甘肃中医药大学附属医院急诊科，甘肃兰州 730000

根据2019年美国癌症协会的最新数据显示，前列腺癌高居美国男性新发癌症的第1 位，其病死率居于第2 位[1]。在我国男性恶性肿瘤发病率中居于第6 位，病死率居于第9 位[2]。晚期前列腺癌患者通常采用内分泌疗法治疗，但经过中位时间18～24 个月后，大多数患者特异性标志物前列腺特异性抗原（PSA）再度升高，提示肿瘤细胞产生了耐药性，临床称为去势抵抗性前列腺癌（castrationresistant prostate cancer，CRPC）[3]。常规治疗无效后，患者通常面临着生存周期缩短，生活质量下降等问题，近年来，中医药在CRPC 患者生存周期以及生活质量等方面取得了较大的进展。

1 资料与方法

1.1 数据来源、录入及规范

电子计算机检索CNKI、万方、维普以及CBM数据库中收录的已公开发表的中医药治疗CRPC 的个人医案。检索时间从2000年1月1日至2021年10月31日，筛选后共纳入29 篇文献，36 个中药处方，将其录入表格进行统计，得出中药113 味，后参照《中华人民共和国药典》[4]以及《中药大辞典》[5]对药物名称进行规范化处理。

1.2 纳入及排除标准

纳入标准：①文章中提出西医诊断为CRPC；②文献中医案处方、药物组成明确，并有明确临床疗效者。排除标准：①诊断不明确或错误的医案；②医案中就诊次数过多且药物变化描述及疗效不明确者。

1.3 数据处理

将处方录入Microsoft Office Excel 2017 统计表格中，经过中药规范化处理后，通过矩阵分析等统计药物频次。

1.4 关键中药治疗CRPC可能机制探讨

利用TCMSP 数据库，将OB、DL 分别设置为≥0.3、≥0.18[6]，以此为筛选条件获取中药活性成分，再次将活性成分的Smiles 结构序列导入Swiss TargetPrediction 数据库预测靶点，以置信度阈值评估预测结果的可靠性。在GeneCards 数据库、OMIM数据库中以“castration-resistant prostate cancer”为关键词检索收集疾病相关靶点；并利用Venny 2.1.0得到潜在靶点。将潜在靶点上传至String 数据库构建PPI 网络；并利用Cytoscape 3.8.2 的CytoNCA 插件筛选关键靶点。最后应用Metascape 进行GO 富集分析与KEGG 通路分析，最后利用R 语言对结果进行可视化处理。

2 结果

2.1 中医药治疗CRPC的中医药统计

通过矩阵分析等统计药物频次，前十位分别为黄芪、熟地黄、茯苓、姜黄、白术、补骨脂、党参、炙甘草、白花蛇舌草、莪术，取以上药物组成“CRPC 治疗方”。

2.2 “CRPC治疗方”中药物活性成分及治疗CRPC的作用靶点

在TCMSP 中筛选后共得到174 个活性成分，其中黄芪20 个、熟地黄2 个、茯苓15 个、姜黄3 个、白术7 个、补骨脂4 个、党参21 个、甘草92 个、白花蛇舌草7 个、莪术3 个，去除重复值共得到157 个活性成分，后通过PubChem 收集药物活性成分的Smiles 结构序列。

将收集到的Smiles 结构序列导入至Swiss TargetPrediction 数据库中预测靶点，去除重复值后共得到136 个作用靶点。利用GeneCards 数据库、OMIM 数据库筛选CRPC 靶点，整理并去除重复值后，共获得1396 个靶点。通过Venny 2.1.0 取药物靶点与疾病靶点交集，共得到99 个“CRPC 治疗方”治疗CRPC 的潜在作用靶点。见图1。

2.3 筛选“CRPC治疗方”治疗CRPC的核心靶点

通过String 数据库和Cytoscape 3.8.2 软件，构建“活性成分-基因靶点”网络图，见图2，根据Degree 值排序可知核心化学成分有槲皮素、木犀草素、山奈酚、甘草查尔酮A、芒柄花黄素等；根据表示靶点之间相关性的Degree 值排序可知核心靶点为STAT3、c-jun、TP53、HIF1A、ESR1 等。

将疾病与处方的交集基因导入至Cytoscape 3.8.2 的CytoNCA 插件中，网络共有91 个节点，716条边，节点的平均Degree 值为15.7。根据BC、CC、DC、EC、LAC 及NC 的中位值进行两次过滤后，可得出“CRPC 治疗方”治疗CRPC 的核心靶点，见图3。

2.4 GO富集分析

在Metascape 数据库中导入99 个疾病药物交集靶点并进行GO 富集分析。分析结果显示，共包括1777 个生物过程、40 个细胞组分以及153 个分子功能。根据P值大小进行排序，选择前10 个结果绘制柱状图，见图4。由图可知，GO 富集分析结果主要涉及应答氧化应激、细胞对化学应激的反应、细胞对氧化应激的反应等生物过程以及膜区、膜微区、膜筏等细胞组分，泛素-如蛋白质连接酶结合、泛素蛋白连接酶结合、蛋白质异二聚活性等分子功能。

2.5 KEGG通路分析

将99 个疾病药物交集靶点导入Metascape 数据库进行KEGG 通路分析，结果显示与PI3K-Akt信号通路、人巨细胞病毒感染、前列腺癌等148 条信号通路有关，并根据通路富集基因的个数排序，取前30 条通路绘制柱状图，见图5。由图可知，基因富集数目最多、最显著的通路是PI3K-Akt 信号通路。并对PI3K-Akt 信号通路进行可视化分析，见图6，由图可知，“CRPC 治疗方”通过多个上下游蛋白调控PI3K-Akt 信号通路。

3 讨论

前列腺癌癌细胞对雄激素途径有高度敏感性，通过激素调控和去势可导致癌细胞死亡，目前CRPC 临床仍常用雄激素剥夺治疗联合糖皮质激素进行治疗，但常出现耐药的问题[6]。因此，寻找一种疗效佳、安全且复发率低的治疗手段具有重要的临床意义。研究发现，苦参碱、姜黄素、人参皂苷等中药单体可通过相关靶点直达疾病要点[7]，使中医药治疗CRPC 取得更进一步的发展，也为CRPC 的治疗提供新的思路及方向。

本研究通过整理近年公开发表的治疗CRPC的中医处方后发现，用药频率前十位的中药分别是黄芪、熟地黄、茯苓、姜黄、白术、补骨脂、党参、炙甘草、白花蛇舌草、莪术；此组方中黄芪、党参、炙甘草益气扶正，茯苓、白术健脾运脾，熟地黄、补骨脂补肾填精，姜黄、莪术行气活血，白花蛇舌草兼清里热。CRPC 的中医病机可概括为本虚标实、脾肾两虚，兼有湿、痰、瘀、毒，综合分析，上述处方治法可总结为“补肾健脾、益气活血、兼清里热”，符合上述病机。遂后期加以网络药理学分析以期揭示其潜在治疗靶点及机制。

分析“活性成分-基因靶点”图，Degree 值排名前三的中药活性成分为槲皮素、木犀草素、山奈酚；以上三种均为黄酮类化合物，具有多种生物活性、广泛的药理作用。经研究发现，单用槲皮素、木犀草素、山奈酚或与化疗药物联合使用表现出抑癌性，其抗癌作用在前列腺癌、乳腺癌、结肠癌等几种癌症中已经显现[8]，对于前列腺癌的抗癌作用可总结如下：①抑制癌细胞增殖及促进凋亡；②抑制癌细胞的侵袭与迁移；③抑制肿瘤血管新生及增加抗癌药物的敏感性；④逆转耐药性；⑤诱导细胞周期阻滞等[9-13]。这与本研究结果相符。

GO 富集分析主要涉及在细胞对化学应激的反应、应答氧化应激、细胞对氧化应激的反应等生物过程，膜筏、膜微区、膜区等细胞组分，泛素-如蛋白质连接酶结合、泛素蛋白连接酶结合、蛋白质异二聚活性等分子功能。KEGG 富集分析主要涉及PI3K-Akt 信号通路、人巨细胞病毒感染、前列腺癌等通路，其中PI3K-Akt 信号通路富集数目最多，提示该信号通路可能与“CRPC 治疗方”的治疗作用密切相关。CRPC 细胞可表达出大量活化的PI3K和Akt，对癌细胞的增殖、代谢及凋亡起到一定的调节作用，且会影响细胞周期，对CRPC 的发展起到十分重要的作用[14]。除此之外，也有学者发现Akt 的激活程度会显著影响预后，且呈正相关[15]。本研究KEGG 通路分析亦提示与人巨细胞病毒感染、前列腺癌等通路密切相关，以上通路亦与CRPC 的发病密切相关，本研究提示，以上分析提示“CRPC 治疗方”的作用机制与多个靶点、多条通路相关，“CRPC治疗方”治疗CRPC 可能通过PI3K-Akt 通路等多条信号通路发挥抗癌等治疗作用。

综上所述，本研究通过处方统计及网络药理学分析探讨了“CRPC 治疗方”治疗CRPC 的潜在作用机制，发现“CRPC 治疗方”可能通过槲皮素、木犀草素、山奈酚等多种活性成分，作用在STAT3、c-jun、TP53、HIF1A、ESR1 等多个疾病靶点，调控PI3K-Akt 信号通路、人巨细胞病毒感染、前列腺癌等通路调节癌细胞的增殖、代谢及凋亡，进而延缓CRPC 的疾病进程，改善患者生活质量。

综上所述，本研究发现“CRPC 治疗方”通过多成分、多靶点、多通路治疗CRPC，这为后续进一步深入研究CRPC 的治疗方法奠定了一定的基础。