荧光PCR 熔解曲线法对痰样本结核分枝杆菌耐药性检测价值及耐药特征分析

吴燕飞 徐丽霞 赖聪娟 季柏林 周琛博 许河南

随着抗结核药物广泛、长期以及不规范使用等因素影响，结核分枝杆菌耐药问题越来越复杂，耐药结核病尤其耐多药结核病（MDR-TB）的发病率日趋增高，耐药性的产生使其具有病程长、病情复杂、治愈率低、病死率高等危害。2020 年全球上报耐多药/利福平耐药结核（MDR/RR-TB）13.2 万例，准广泛耐药或广泛耐药结核病2.6 万例，合计约15.8 例，较2019 年下降22%，据估算我国耐药结核病发病率居全球前三位[1]。2017 年，《肺结核诊断标准》把结核分枝杆菌（MTB）分子生物学检查纳入结核病病原学诊断范围[2]。熔解曲线法是一种将基因扩增与耐药基因突变分析融为一体的实时荧光PCR 分子生物学检测技术，与传统液体药敏试验相比，该方法可直接应用于临床痰样本MTB 耐药基因检测，缩短MTB 耐药性检出时间，作为耐药结核病快速筛查、诊断的分子辅助检查技术，该方法仍然需要大量临床检验数据及方法学比较验证其准确性等检测效能[3-5]。本研究采用熔解曲线法检测临床结核患者涂阳痰样本MTB 对一线抗结核药物链霉素（SM）、异烟肼（INH）、利福平（RFP）、乙胺丁醇（EMB）耐药基因突变情况，并与阳性痰样本相应培养的MTB 分离株液体表型药敏试验结果进行比较，评价熔解曲线法在痰样本中对耐药MTB 快速检测的临床应用价值。

1 实验材料

1.1 样本及菌株来源 收集2019 年11 月至2021年1 月浙江省丽水市中医院（结核病定点医院）就诊的肺结核患者抗酸染色涂片阳性痰液样本，通过MGIT 960 全自动分枝杆菌快速培养系统进行分离培养，获取相应阳性菌株，并经过结核分枝杆菌复合群鉴定，共获得MTB 涂片阳性痰样本（痰样本提取核酸前冻存于-80 ℃冰箱）和相应结核分枝杆菌分离株各142 例。

1.2 主要仪器、试剂 美国BD MGIT 960 全自动分枝杆菌快速培养仪、液体药敏检测仪（型号：MGIT 960）；广东希格生物科技细菌超声分散计数仪（型号：1100c）；厦门致善生物科技公司全自动核酸提取仪（型号：Lab-Aid 824）；上海宏石科技公司全自动PCR 分析系统（型号：SLAN-96S）；美国BD MGIT 960 配套分枝杆菌培养试剂盒（营养添加剂：批号0230862，药敏试剂盒：批号0364621）；珠海贝索抗酸染色液（冷染法，批号C200401）；杭州创新生物检控技术有限公司结核分枝杆菌抗原检测试剂盒（胶体金法，批号GE210301）；厦门致善生物科技核酸提取及MTB 耐药基因突变检测试剂盒（链霉素：批号20102701，异烟肼：批号20090801，利福平：批号20102601，乙胺丁醇：批号20121801）。

2 方 法

2.1 抗酸染色法 采用萋尼抗酸染色法，挑取痰标本脓样、干酪样部分0.05～0.1 mL，于玻片中间均匀涂抹1 cm×2 cm 卵圆形痰膜，干燥后固定；复红染液染色15 min，冲去染液，脱色液脱色5 min，洗去脱色液，再次脱色至无可视红色；轻缓冲洗，沥水，亚甲兰复染液复染30 s；轻缓冲洗，干燥后镜检。

2.2 BACTEC MGIT 960 液体培养及鉴定 将合格痰样本加入样本处理液（将6%NaOH 100 mL 和2.9%柠檬酸钠溶液100 mL 混匀后加入1.0 g N-乙酰-L-半胱氨酸），液化处理15 min，离心后弃上清，1.5 mL PBS 重悬，取500 μL 加入已添加MTB 营养添加剂的MGIT 培养管，混匀后放入MGIT 960 分枝杆菌自动培养系统，待仪器报阳，取培养菌液涂片，萋-尼抗酸染色法确认为抗酸分枝杆菌，经结核分枝杆菌MTB64 抗原法检测，确认为结核分枝杆菌复合群。

2.3 液体药敏试验 按说明书加4 mL 蒸馏水复溶药液（链霉素、异烟肼、利福平、乙胺丁醇）；用无菌吸管吸取新鲜结核分枝杆菌培养菌液约1 mL，转移到无菌试管中，采用细菌超声分散浊度仪分散混匀，并用生理盐水调整至0.5 麦氏浊度工作菌液；向对照管、药敏管各加入0.8 mL 营养添加剂，对照管中加0.5 mL 1∶100 稀释后的工作菌液，向每个已配制含药SM 1.0 μg/mL、INH 0.1 μg/mL、RFP 1.0 μg/mL、EMB 5.0 μg/mL 培养管中加0.5 mL 工作菌液，混匀后放入全自动培养仪，进行液体比例法药敏试验，药敏结果以仪器报告为准。

2.4 痰样本核酸提取 取合格MTB 痰样本1 mL 加入等量样本处理液（NaOH-N-乙酰-L-半胱氨酸），充分混匀液化处理15 min，3000 g 离心15 min，弃上清，加200 μL MTB 核酸提取液，99 ℃金属浴20 min，转入Lab-Aid824 自动磁珠法核酸提取试剂盒提取核酸。

2.5 荧光PCR 熔解曲线法 采用荧光探针PCR 熔解曲线法进行MTB 耐药基因突变检测，提取核酸瞬间离心后，取5 μL 核酸上清液作PCR 模板，加入配制好的20 μL PCR 反应液的反应管，放入全自动PCR 熔解曲线分析仪，按照相应药物预设程序（UNG处理-预变性-Touchdown 循环-PCR 循环-熔解曲线分析）进行PCR 扩增反应同时进行熔解曲线分析，仪器根据熔点（TM 值）自动判读试验样本对相应药物耐药性。

2.6 统计学方法 应用SPSS 22.0 对试验数据进行分析，两种方法结果比较采用χ2检验。以液体药敏试验为金标准，计算熔解曲线法结果的灵敏度、特异度、符合率[灵敏度=真耐药例数/（真耐药例数+假敏感例数）；特异度=真敏感例数/（真敏感例数+假耐药例数）；符合率=（真耐药例数+真敏感例数）/（真耐药例数+假敏感例数+假耐药例数+真敏感例数）；阳性预测值=真耐药例数/（真耐药例数+假耐药例数）；阴性预测值=真敏感例数/（真敏感例数+假敏感例数）]，评价该方法检测MTB 耐药性临床应用价值。采用Kappa 值对两种方法进行一致性检验，若Kappa值≥0.60 提示两者具有较好一致性。P<0.05 表示差异有统计学意义。

3 结果

3.1 抗酸染色及分枝杆菌分离培养及鉴定 采用萋-尼染色法抗酸染色阳性痰样本，经MGIT 960 液体培养分离分枝杆菌阳性菌株，通过结核分枝杆菌MTB 64 蛋白抗原法检测阳性，确定为MTB，得到142 例MTB 阳性痰样本及相应MTB 临床分离株。

3.2 药敏试验结果 将收集的142 例涂片阳性痰样本MTB 核酸采用荧光PCR 熔解曲线法进行结核分枝杆菌耐药性检测，结果显示，链霉素耐药20 例，异烟肼耐药18 例，利福平耐药15 例，乙胺丁醇耐药5例；同时将与涂阳痰样本相对应培养的142 例MTB菌株，经液体表型药敏试验检测，结果显示，链霉素耐药14 例，异烟肼耐药20 例，利福平耐药12 例，乙胺丁醇耐药7 例。见表1。

3.3 方法学比较 以液体药敏试验结果为金标准，对熔解曲线法检测MTB 样本耐药性效能进行分析，熔解曲线法检测SM 灵敏度78.57%，特异度92.97%，符合率91.55%；检测INH 灵敏度为70.00%，特异度96.72%，符合率92.96%；检测RFP灵敏度100.00%，特异度97.69%，符合率97.89%；检测EMB 灵敏度为71.43%，特异度100.00%，符合率98.59%；表明熔解曲线法四种MTB 耐药检测试剂盒灵敏度、特异度较高，熔解曲线法与液体药敏检测结果一致性较好，熔解曲线法对MTB 耐药性检测具有较好性能。见表2。

4 讨论

熔解曲线法是一种快速荧光探针PCR 检测技术。该法PCR 荧光探针设计可以进行SM、INH、RFP、EMB 等抗结核药物相关位点（rpsL、rrs、ahpC、inhA、katG、rpoB、embB）的耐药基因突变检测[6-8]；对一、二线抗结核药物耐药突变检测的灵敏度、特异度和符合率均具有良好的检验效能[9-11]。

本研究结果显示，熔解曲线法对SM 灵敏度78.57%，特异度92.97%，与邹远妩等[9]的研究结果（84.84%和93.18%）较一致。检测INH 灵敏度为70.00%，特异度96.72%。灵敏度低于以往研究结果，主要原因可能有两方面，一是纳入检测的INH 耐药样本数较少等原因引起，另外由于INH 耐药与多基因位点突变相关，熔解曲线法检测位点覆盖不全造成。检测RFP 灵敏度100.00%，特异度97.69%。这与刘立宾等[12]的研究结果（94.44%和96.21%）较一致。检测EMB 灵敏度71.43%，特异度100.00%。EMB 灵敏度检测较低，主要原因可能是熔解曲线法覆盖embB 基因306、378、406、497 位点突变检测，而无法检测embA，embC、embR 等其他基因的突变。两种检验方法对SM、INH、RFP、EMB 耐药检测的灵敏度和特异度差异均无统计学意义。

研究中，熔解曲线法对142 例临床结核涂阳痰样本MTB 耐药检测，其中SM 耐药20 例，假阳性9例，其中5 例存在双峰现象，经分析可能一部分是由于MTB 不均一性耐药导致，另一部分原因可能是部分杂合峰样本被判读为阳性，需要复检或结合表型药敏试验判断最终结果；SM 敏感122 例，假阴性3例，分析可能由于熔解曲线法仅检测MTB 由rpsL 基因43 位88 位密码子以及rrs 基因513～517 位点突变引起的耐药，而由其他基因突变或其他SM 耐药机制引起的耐药不能检测导致；INH 耐药18 例，假阳性4 例，分析可能与熔解曲线法只检测核酸序列突变，因此，那些不引起氨基酸改变的突变（沉默突变）也会被判为突变型，从而出现假阳性结果；INH 敏感124 例，假阴性6 例，可能原因是熔解曲线法仅检测MTB ahpC 启动子区（-44～-30 以及-15～3 位点）、inhA 启动子区（-17～-8）位点、inhA94 密码子和katG315 密码子突变引起耐药，由其他突变或其他INH 耐药机制引起的耐药不能检测。RFP 耐药15例，假阳性3 例，经分析考虑可能为沉默突变而未引起相关生物学功能变化，RFP 敏感127 例，假阴性0例；EMB 耐药5 例，假阳性0 例，敏感135 例，假阴性2 例，可能原因是由于试剂盒未能覆盖EMB 所有耐药突变位点所致；另外，熔解曲线法假阳性可能由于试剂批次及熔解曲线偏峰、干扰峰等引起，假阴性可能与基因耐药与表型耐药不符导致，需要对MTB 耐药机制进一步探索分析。

综上所述，熔解曲线法在检测SM、INH、RFP、EMB 等抗结核药物的耐药性方面具有较好的特异性和符合率。与液体药敏法相比，该方法能在短时间内完成涂阳痰样本MTB 耐药性初步筛查，可为临床提供耐药结核病辅助诊断价值。由于检测突变位点覆盖率不全及阳性样本数少等局限，致使检验效能比较可能存在偏倚，今后还需扩大样本数研究，熔解曲线法联合多种耐药检测方案有助于进一步提高MTB耐药性检验效能。