家蚕育种技术研究进展

杨 尚，宋兴亚，赵 鹏，吕颖贤，于 翔，袁 颖，黄永震，朱绪伟*

（1.河南省蚕业科学研究院，河南 郑州 450000；2.西北农林科技大学动物科技学院；3.河南省农学会；4.河南省动物卫生监督所）

家蚕又名桑蚕，是一种具有极高经济价值的鳞翅目昆虫，不仅用于养蚕业，还用于许多科学领域。从农耕文明的养蚕缫丝到工业文明的轻纺工业，家蚕一直扮演着重要角色。在我国悠久的养蚕历史中，不同地区因地制宜，饲养适应当地条件的家蚕品种。自然条件和人为干预的选择使得分布在不同地区家蚕的遗传资源更加复杂化和多样化，这为选育工作提供了丰富的原始资料。对家蚕品种选育方法的改进可以提高养蚕的生产效率和经济效益，从而推动整个家蚕产业的发展。

1 家蚕选育的必要性

家蚕养殖技术起源于中国，随着“一带一路”倡议在国际上被广泛认同，南亚、东南亚及非洲等地的一些国家对蚕丝的热情格外高涨［1］。丰富的土地资源和廉价的劳动力使得这些国家发展桑蚕产业有着得天独厚的优势。印度的蚕丝生产量已经紧随中国之后，位居世界第二，而巴西虽然产业规模小，但能生产世界最优质的生丝，成为一些世界奢侈品的原料专供地［2］。这些国家蚕桑业的发展使得我国蚕桑业遭受极大的考验，发展环境不容乐观。加快产业转型和品种培育便是提高我国蚕桑产品国际竞争力的出路。因此，培育出“体质强健、多抗好养、优质高产、繁育能力强”的优质蚕种势在必行。

2 家蚕育种基本思路

2.1 确定合理的育种目标

育种目标的确定是为了让动物生产获得更大的经济效益，这是育种工作中最为重要的决策。目标的偏离或是不合理，会导致动物世代间的遗传进展极大降低甚至背道相驰。因此，合理的育种目标可以为育种计划的制定指明方向，让育种工作少走弯路。

确定合理的育种目标需要综合多方面因素全面考虑，主要需要包括以下要素：

2.1.1 市场需求

动物生产的最终目的都是为人类提供服务，这决定了家蚕育种也必须以市场需求为出发点，明确在育种中应该提升或改变哪些性状。综合考虑家蚕和蚕丝的相关性状来顺应市场需求，这样的育种工作才有意义。但同时因为育种的效果存在滞后性，即育种群的遗传进展要经过杂交繁育的代代传递，并且世代之间取得的遗传进展有限，同时我国的家蚕良种繁育采用严格的三级繁育、四级制种制度，一个优良家蚕品种从理论育成到实际推广，需要几年时间。所以在制定育种目标的时候不能只简单地看到当下的市场需求，必须要对市场做出一定的预测，预测短期、中期、长期的市场需求。

2.1.2 育种素材

预测市场需求后，育种工作的开展已经有了方向，但要实际开展，必须要有物质条件——育种素材，有满足条件的育种素材才可以继续进行实际的育种工作。因此，必须充分了解现有的育种群，包括核心群数量、群体结构、性状均值、遗传参数、近交系数和群体之间的配合力等等。然后再根据这些育种群的情况，来选择符合育种目标的育种群进行杂交，标准品种不能满足需要的时候可以引进地方品种血统。

2.2 选择育种素材

根据育种目标选定改良的性状，选出符合条件的纯种群体，如育成带有对生产影响大的家蚕疾病抗性基因的蚕种、某些产品对蚕丝品质有更高的要求、部分地区受氟污染影响严重需要选育出耐氟品种等等。当前主要通过多元杂交的方式进行育种，这就要选择带有不同突出性状的种群作为父本和母本，从而把双亲的性状综合到新品种身上。

2.3 预测育种效果

我国家蚕品种资源丰富，仅根据育种目标初步筛选出的育种群，可能会有很多群体进入备选名单。如果直接开展杂交试验，结果不尽人意，就会耗费大量人力物力和时间，因此在进行杂交之前，需要对不同组合的杂交效果进行大致估计，以此筛选出成功率较高、杂交效果好的组合进行杂交试验。

长期以来人们一直在探索可以准确预测出杂交效果的方法，现在被广泛应用的方法主要有两种：一是遗传距离法；二是配合力预测法。遗传距离法利用基因的相对距离来反映基因交换的概率，但其只能估计群体间的差异程度，对单独性状的生产性能无法准确预测。之前有研究通过DNA 多态性遗传距离来预测杂交效果，结果显示以DNA 多态性遗传距离筛选出的杂交组合能够获得更优的生产性能［3］。配合力预测法目前发展较为成熟，在生产实践中广泛应用。在其他动物的研究中有将配合力预测放在基因组水平上的报道［4］，可以在早期选种节约时间，提高选择效率，目前在家蚕中尚未见有此研究。

2.4 新品系选育

根据确定好的育种目标和杂交组合，采用杂交的方式，再对子代进行系统选择，一般杂交进行到第3、4代后，换为同蛾区交配的方式，即互为全同胞的雌雄个体之间交配，可以比较容易地得到更加稳定的遗传性状。

3 育种技术进展

20世纪以来，连续个体选择法和系统选择法的出现，使得家蚕育种取得两次飞跃性的进步［5］，也将家蚕育种推向了一个高峰。随着时间的迁移，传统育种方法的局限性慢慢显露出来：有限的遗传资源在漫长的时间里几乎被发掘完全。

但随着技术的快速进步，分子生物学等领域取得许多技术创新和技术突破，并被迅速应用在动物育种上，让育种工作可以在基因水平挖掘品种的潜力，为育种工作的开展注入新的活力［6］。

3.1 物理诱变制造育种素材

物理诱变是制造基因突变的有效手段，但由于其诱变方向的不确定性和生物安全问题，物理诱变在动物育种中的应用不如在植物和微生物中的广泛。诱变方向的不确定性使得诱变育种在动物育种上的应用极大受限，原因是动物相较于植物和微生物而言，存在繁殖力低、世代间隔长、培育成本高等特点。家蚕作为昆虫，与其他动物相比，繁殖性能强且世代间隔短，因此，20 世纪末一些科研院所应用物理诱变的方法来获取新的家蚕育种材料。

安徽省农业科学院蚕桑研究所和中国科学院等离子体物理所联合开展低能氮离子（N+）对家蚕的诱变育种研究：将N+注入家蚕雌蛹及卵中，诱发基因突变，随后在获得的变异群体中选择表现优于对照组，即获得有益突变的个体，作为育种素材，用以培育新的优良品种［7］。山东蚕业科学研究所育成的“C66”和“烟6”以及辽宁蚕业科学研究所选育的“多丝3 号”都是采用激光照射处理蚕卵或蚕蛹获得的柞蚕新品种［8］，也可参考用在家蚕的诱变育种中。

3.2 基因组技术挖掘育种潜力

随着基因组技术的发展，我国在1996 年提出家蚕基因组计划，在2004年公布了家蚕基因组序列草稿，随后以西南大学为主的跨国研究团队于2008年在此基础上完成了家蚕基因组精细图谱，将家蚕全长cDNA序列整合成长度为432Mb、包含14 623 个基因的完整基因组序列、次年以29 种家蚕和11 种野生蚕为材料进行了全基因组重测序，鉴定了基因组多态性，构建了单碱基对解析的高精度家蚕遗传变异图。有关专家基于重测序数据构建了第1个针对家蚕的CNV图谱，并在家蚕基因组中共鉴定出319个CNVs。这些研究在家蚕基因组中筛选出了大量稳定存在的SNPs 和SVs 等遗传突变，提出了许多与家蚕的生长发育及经济性状等关联的候选基因，可作为家蚕分子育种的分子标记，揭示家蚕杂交育种机理的同时，为广泛开展分子育种工作打下了基础。

3.3 基因编辑拓宽育种道路

越来越多物种基因组的公布，基因组编辑也应运而生。ZFN、TALEN 等基因核酸酶的发现，还有被称为“基因魔剪”的CRISPR使得基因编辑技术在世界范围内引起空前关注。

3.3.1 依赖ZFNs的基因组编辑

ZFN基因编辑技术适用于家蚕育种，将ZFN mRNA直接注射到胚胎中，可以省去构建表达载体等步骤并且不需要酶的异位表达，极大地缩减了进行家蚕基因编辑的时间。该技术另一个主要的优势在于ZFs 可以进行自定义修饰，以构建具有新的切割特异性的核酸酶。

3.3.2 依赖TALEN的基因组编辑

TALEN可以对基因进行定点突变是基于细菌TAL效应蛋白的作用，步骤包括TALEN 的组装，离体TALEN RNA 的合成、胚胎显微注射及突变检测和PCR 分析。有关专家同样用BmBLOS2 基因来表示TALEN 基因编辑的准确性，结果证实TALEN有更高的成功率，该结论在其他动物中也得到了验证，并且TALENs的设计和构建非常简单和快速。

3.3.3 依赖CRISPR-Cas的基因组编辑

在当下各种基因编辑方法中，避免脱靶效应至关重要。CRISPR/Cas9 系统以其高效率、高保真性和简单性，从而成为最受欢迎和最广泛应用的系统。CRISPR/Cas9通常由一个Cas9蛋白质与单一引导RNA（gRNA），两者形成一个蛋白质-RNA 复合物，然后切割目标。使用CRISPR-Cas 系统对家蚕的大多数研究都集中在使用CRISPR-Cas系统进行功能基因分析，以阐明某些机制，或增强蚕对BmNPV 的抵抗力。

有关专家首次报道了使用CRISPR-Cas9 工具编辑家蚕基因组的成功操作：作者针对一个必需基因BmBlos2，它与人类Blos2 基因直系同源。设计了两个sgRNA（23-bp）以诱导导致靶基因功能丧失的突变。由1 个sgRNA 和Cas9 核酸酶形成的每个复合物都被注射到前胚层胚胎阶段。通常，幼虫体被不透明，但当BmBlos2 基因功能丧失，外皮变成半透明。这种效应可以被视为突变体检测的表型标记。

有关专家在家蚕中利用CRISPR/Cas9 系统获得去除家蚕核多角体病毒的转基因个体，揭示了一种通过使用强大的CRISPR-Cas 方法抑制不同家蚕的有前景的策略。IGFLP已被证实在家蚕体内参与成长过程，有关学者使用CRISPR/Cas9基因组编辑工具敲除IGFLP基因，发现与野生型相比，IGFLP 基因的缺失导致卵巢更小，产卵数量更少。

为了让家蚕能够生产高性能纤维，有关专家使用CRISPR-Cas9 成功敲入了蚕基因组中的蜘蛛丝基因，为了避免干扰蛋白质的产生，将蜘蛛丝基因敲入BmFibL或BmFibH 的内含子之一，证明了在家蚕中使用CRISPR-Cas9 在工业规模上获得具有增强机械性能丝绸的可行性。

有关专家发现了两个新的CRISPR 系统Saca 9 和AsCpf 1，这两个系统也可以进行高效的位点特异性基因组编辑，并构建了完整的CRISPR系统，通过集成系统，在平均6.5个碱基对中就找到一个可定位的靶点，极大地便利了基因组水平开展的育种工作。

此外，CRISPR-Cas 还被用于家蚕中进行表观遗传修饰。在这种情况下，有关专家探讨甲基化对家蚕发育的影响。该研究为研究靶位点DNA 甲基化重要性提供了一种策略，具有重要意义。此外，他们的研究代表了探索DNA 甲基化状态对家蚕及其他不同表型影响的起点。

家蚕育种在我国已经有近千年的历史，技术的飞快进步和育种工作者的辛勤劳动给家蚕育种行业注入了源源不断的动力。育种工作从确定育种目标到选择育种素材、从预测育种效果到选育新品系，步步是关键。21世纪生物技术的飞速发展，从随机突变到精确敲除、从单纯的基因突变体制作到多样化的基因组精确编辑，家蚕全基因组的公布和基因编辑工具的升级给家蚕的研究与育种带来了变革性的影响，抓住机遇，家蚕育种将进入全新的高速时代。