两起兽医PCR实验室核酸污染原因排除及消毒成效的调查及建议

孙剑峰，王占利，康文彪，豆玲，赵雯，高军军

（甘肃省动物疫病预防控制中心，甘肃兰州 730046）

甘肃省大多数基层兽医实验室已经具备分子生物学检测能力，实验队伍人员配置齐全、素质高，实验室建设合理，市县级兽医实验室每年省级比对结果正确符合率超过90%。现阶段PCR试验已经是病原学检测的成熟手段，分子生物学实验室主要开展实时荧光PCR试验，普通PCR试验由于要进行电泳等步骤已经很少用。近几年兽医分子生物学实验室很容易发生核酸污染[1]，尤其在春秋两季集中监测样品任务量特别大的情况下，加上试验人员水平层次不平，有的分子学实验室构造不合理，试验结束后消毒和废弃物处理程序不规范，极易造成污染。实验室一旦污染及污染后消毒处理不当会导致近段时间无法进行试验，寻找污染步骤及祛除污染需要花费大量人力和试剂[2]，因此预防核酸污染才是关键。现结合两起兽医PCR实验室污染原因查找过程及祛除核酸污染过程，总结出相应污染原因及控制和清除核酸污染的措施。

1 调查对象及寻找污染原因的方法

调查对象是一个兽医PCR实验室。寻找污染原因的方法是通过查看每次做的试验结果，对发现有多份阳性的试验用增设空白对照验证是否污染，如果确实污染就要采集可能污染地方样品，通过比对试验查找污染原因，比对试验主要是不同部位样品比对、试剂比对、人员比对、实验室比对、仪器比对等，通过相应消毒措施后再用试验验证核酸污染是否祛除。

2 实验室构造、主要使用仪器和试剂情况

2．1 实验室构造

该兽医PCR实验室有4个单独分区，依次是试剂准备间、样品处理及提取间、核酸扩增间、电泳间，压力分别从正压到负压，每个区之间有传递窗，没有单独的缓冲间，排风系统是中央空调系统，每间有2个排风口，样品提取间有2个生物安全柜，1个臭氧消毒机。

2．2 主要使用仪器

全自动核酸提取仪（西安天隆，型号：NP968）,3台荧光PCR仪（ABI 7500，ABI Q5，Agilent）,4台高速离心机。

2．3 主要使用试剂

天隆核酸提取试剂盒（批号：E0119090321），哈尔滨元亨生物药业有限公司的ASFV荧光PCR检测试剂盒（批号：ASFV2021004），FMDV通用型实时荧光RTPCR检测试剂盒（批号：FMDV20200601P），青岛立见的ASFV荧光PCR检测试剂盒（批号：40222104），兰兽研FMDV荧光定量RT-PCR检测试剂盒（批号：20210909431），青岛立见核酸祛除剂（批号：140321906），纳克生物科技有限公司PCR核酸质粒气溶胶污染清除剂（批号：2021060500），84消毒液，70%酒精，30%过氧化氢，自配含氯消毒剂。

3 调查结果

2021年6月份，该兽医PCR实验室在春季定点检测试验中发现非洲猪瘟病毒核酸污染，试验结果分析过程中发现ASF阴性对照和部分样品核酸阳性，经过几次重复试验阴性对照为阳性，怀疑实验室被ASF核酸污染，通过反复试验验证发现是提取区移液器和一个生物安全柜台面被污染。

2021年11月份，该兽医PCR实验室在秋季集中监测试验中发生口蹄疫病毒核酸染，96孔反应板中阴性对照和空白对照都是FMDV核酸检测阳性，检测样品零散阳性和多份可疑，重复试验结果都有弱阳性出现，且结果对不上，做了人员比对和试剂比对，结果还是一样，怀疑实验室被FMDV核酸污染，通过实验室比对、试剂比对、仪器比对等发现提取间环境被FMDV气溶胶污染。

4 核酸污染原因排除、祛除核酸污染过程分析及消毒成效验证

4．1 ASFV核酸污染原因排除、污染祛除与消毒验证过程

4．1．1 ASFV核酸污染原因排除

在当天非洲猪瘟病原学试验中，试验阴性对照有1份阳性和1份可疑，换了试剂进行重复试验结果一致，实验室可能污染了。换了间PCR实验室和用两种试剂同时开展试验，开始设立4份空白对照和20份环境样品（盛有3 ml PBS的5 ml离心管中开盖静置12 h在提取间和扩增间），再进行ASFV荧光PCR试验，24份样品全为阴性（试验成立），说明实验室环境和试剂没有污染。接着通过反复擦拭采集移液枪头部及内部、离心机孔里、96孔离心板孔里、生物安全柜台面、地面等18份样品，用2种试剂继续在新PCR实验室进行ASFV荧光PCR试验，结果显示1份移液器样品和2份生物安全柜台面样品ASFV核酸检测阳性，其余样品均为阴性；换了提取间另一个生物安全柜（有自己独立的移液器），重新用全自动核酸提取仪和手动柱式滤膜提取这18份样品，同时设立空白对照，18份样品检测结果全为阴性且试验成立，说明之前HFsafe 1200的生物安全柜台面及里面的移液器被污染了。

4．1．2 ASFV核酸污染祛除过程

将污染的生物安全柜台面放置在地上，先用酒精擦拭台面内外，用除锈剂对安全柜生锈地方进行擦拭（生锈地方容易吸附核酸），用核酸消除剂对台面和安全柜各个部位进行喷雾消毒[2]，安装好台面，配好3%过氧化氢放置在台面进行熏蒸消毒6h（安全柜密封状态），用酒精、核酸消除剂该安全柜移液器进行拆卸擦洗、喷雾及安装后高压灭菌。

4．1．3 消毒验证过程

用之前非洲猪瘟已知盲样6份和重新擦拭采集该生物安全柜台面和所有移液器样品及提取间环境样品共20份，在污染的实验室进行ASFV荧光PCR试验，已知盲样结果完全正确，19份样品阴性，1份安全柜台面样品可疑，重复消毒，1周之后重新采样进行重复试验结果全阴性，ASFV核酸污染消除，实验室恢复正常工作。

4．2 FMDV核酸污染原因排除、污染祛除与消毒验证过程

4．2．1 FMDV核酸污染原因排除

在2021年秋季集中监测中开展FMDV实时荧光RT-PCR试验时，扩增后96孔反应板中阴性对照和空白对照都是FMDV核酸检测可疑或阳性，检测样品零散阳性和多份可疑，重复试验结果都有弱阳性及可疑出现，且结果对不上，换了人员和试剂进行重复试验结果一致，实验室可能污染了，马上停止试验查找污染原因。首先换了间新的PCR实验室，用之前的试剂和样品开展试验，并设立2份空白对照，结果原先样品全为FMDV核酸阴性且试验成立；配制PBS后高压30 min，分装2ml在离心管（规格5 ml）中，用无菌棉签蘸取灭菌蒸馏水在可能污染地方（移液枪尖里外两面、离心机孔里、96孔离心板孔里、安全柜台面、地面）涂抹采样18份和环境采样10份（装有PBS的离心管静置12h），在新的分子生物学实验室进行FMDV实时荧光RT-PCR试验（全自动核酸提取仪提取和用两种扩增体系），试验成立（阴阳性对照及空白对照满足说明书要求），两种试剂结果一致（试剂没有污染），离心机孔里、安全柜台面、地面出现4份阳性和1份可疑样品，环境样品出现1份阳性和2份可疑样品，证明实验室被口蹄疫病毒气溶胶污染。这次污染比6月份那次严重多了，查找可能污染步骤，怀疑是阳性对照扩增产物没有处置得当，因为该实验室的扩增产物在体表喷洒84消毒液后放入提取间生物安全垃圾桶中，八连管管盖如果没有完全密封，扩增产物就会污染实验室。

4．2．2 FMDV核酸污染祛除过程

整个PCR实验室都要彻底清扫消毒，将污染的生物安全柜台面及角落、离心机各个孔里、实验室台面先用酒精擦拭2遍，再用核酸消除剂喷雾消毒2遍，地面用5%的含氯消毒剂擦拭消毒[3]，提取间生物安全柜用配好3%过氧化氢放置在台面进行熏蒸消毒不少于6 h，并对枪尖盒、枪架、96孔离心管架用5%的含氯消毒剂浸泡消毒，消毒处理提取间所有敞开或用过的耗材，扩增产物用10%的含氯消毒剂浸泡12 h并转移到废弃物临时贮存室 ；打开整个PCR实验室的紫外灯及移动紫外灯照射消毒6 h，紫外消毒结束后打开臭氧机8 h（保持闭光状态即关灯拉窗帘，等臭氧消毒结束后2d每天打开空调系统12 h），1周后重复上次的消毒。

4．2．3 消毒验证过程

消毒半个月后重新采样验证消毒效果，用口蹄疫已知盲样5份和重新采集原先CT值比较小的部位样品及提取间环境样品共17份，在消毒过的实验室进行FMDV实时荧光RT-PCR试验，实验结果（阴性对照翘尾），11份样品阴性，2份离心机和1份地面样品阳性，3份环境样品可疑；每半个月重复之前步骤一次，1个月后重新采样15份，用5份盲样和2份无RNA酶水验证试验，15份样品和2份无RNA酶水全阴性，盲样和阴阳性对照都正确，PCR实验室不消毒空置半个月后重新采样15份进行FMDV实时荧光RT-PCR试验，结果全为阴性，实验室核酸污染消除，该实验室恢复正常检测工作。

5 预防、清除兽医PCR实验室核酸污染的建议

5．1 兽医PCR实验室核酸污染预防措施的建议

（1）制定科学严禁的PCR实验室管理制度。分子生物学实验室负责人加强操作人员监督，划分职责，责任到人，落实制定制度[3]。

（2）改造不合理的PCR实验室布局。最少3个区，一般4个区，依次为配液间、样品处理及提取间、核酸扩增间、电泳分析间[4]，4个分区必须相互独立（包括仪器设备、抹布、拖把等），如提取间移液器不能从扩增间直接到配夜间，配液间（属于洁净区）要有单独的衣服和消毒设施，坚决不能让阳性样品进入配液区。

（3）定期开展试验人员培训。进行岗前培训，开展加强PCR试验人员生物安全意识和试验规范操作的培训，严格落实废弃物处理制度。

（4）PCR试验规范操作。一旦污染需要很长时间清除，只有规范操作，才能更好防止PCR实验室污染。开展PCR试验前，先做好试验准备，打开通风设备和空调系统，穿干净消过毒的试验服和鞋，戴好一次性口罩、手套、帽子，将试剂盒放置室温半小时后进行试验。进行PCR试验时，先分体系放置到配夜间-20℃冰箱中，然后进行样品提取扩增，尽可能使用可高压处理的移液器和一次性带滤芯的无RNA酶枪尖；组织和全血样品处理最好在安全柜台面铺设一次性防水台布，每次离心管开盖前要离心防止盖上残留液体溅出，如果溅在手套和安全柜台面后立即更换手套和消毒台面（先用酒精擦拭再用5%含氯消毒剂喷洒消毒）；每次试验须设立2份阴性对照，移液器严格按照操作规程进行，每年对移液器进行校准维修保养和定期更换生物安全柜的过滤网及空调过滤器，加模板时最后加阳性对照（先离心再小心开盖，模板加完后八联管盖一定要盖紧）。每次试验结束后，形成消毒程序，先将生物安全废液缸里面废弃试剂耗材倒入生物安全垃圾袋里及时进行高压灭菌处理再转移至临时贮存室，PCR产物用10%含氯消毒剂浸泡消毒（不高压处理），将剩余的试剂耗材密封保存，酒精擦拭安全柜台面后喷核酸消除剂进行消毒，擦拭消毒移液器后并定期进行高压灭菌，消毒台面和试验地面用5%的含氯消毒剂擦拭两遍，各个房间的抹布、拖把不能混用，清扫消毒完后打开安全柜和各区紫外灯照射1 h。

5．2 清除兽医PCR实验室核酸污染的建议

（1）实验室一旦发现污染，立即停止试验，用实验室比对、试剂比对、样品比对查找污染原因，找到可能污染重点部位，进行重点消毒，如果是核酸气溶胶污染要关闭整个实验室，并进行彻底清扫消毒。

（2）严格按消毒程序进行操作。整个PCR实验室进行彻底清扫消毒（消毒液现配现用，消毒液严格按比例进行配制），将污染部位先用酒精擦拭2遍，再用核酸消除剂喷雾消毒2遍，试验地面及死角用5%的含氯消毒剂擦拭两遍[5]，生物安全柜用配好3%过氧化氢熏蒸消毒不少于6h，打开整个PCR实验室的紫外灯及移动紫外灯照射消毒不少于6h，紫外消毒结束后打开臭氧机8h，臭氧消毒结束后每天打开通风系统12h，如此反复消毒直至核酸污染祛除。

（3）初次消毒验证污染祛除后，实验室打开通风系统（每天6h）空置半个月后，重新用试验进行验证合格后再恢复实验室正常工作。