人滋养层干细胞的分离培养与鉴定

陈娟 马征来 卢永收 潘文霞 武传叶 孙美英 李超

(1 青岛大学附属医院产科，山东 青岛 266003； 2 临沂市妇幼保健院产科)

细胞滋养层细胞(CTB)来自于胚胎的滋养外胚层[1-2]，被称为人滋养层干细胞(hTSCs),在胚胎植入早期可分化为两种表型，一种是彼此融合形成的合体滋养细胞(ST)，参与胎盘的营养、代谢、内分泌等过程；另一种是绒毛外滋养层细胞(EVT)，位于胎盘绒毛的尖端处，具有从胎盘尖端向子宫间质和肌层血管迁移和侵袭性生长的能力[3]。滋养层细胞(TB)是胎盘功能的主要承担者[4-5]，反复自然流产、早产、妊娠期高血压、胎儿宫内生长受限等均与TB生物学功能异常有关[6-7]。由于人类胎盘的体内研究存在伦理学问题[8]，因此通过体外培养方法获得足够数量且可靠稳定的hTSCs成为TB生物学功能研究的关键[9-10]。目前已经成功构建了大鼠、小鼠、恒河猴等多种动物的胎盘模型[1，11]。1998年首次从小鼠的囊胚和胚外外胚层中分离出小鼠滋养层干细胞(mTSCs)[12]。2018年又从人类妊娠早期的绒毛组织中分离出具有分化为TB潜能的细胞株，命名为TSCT，接着通过该培养体系又从人类囊胚培养获得与TSCT形态相似的细胞株，命名为TSblast，且TSblast的分子特征、转录水平以及分泌功能与妊娠早期胎盘的TB相似[13-14]。本研究在综合分析先前培养方案的基础上，对培养方法进行改进，以分离培养hTSCs，为TB相关生理和病理机制的研究提供体外模型。现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料及试剂

收集临沂市妇幼保健院生殖医学科患者自愿捐赠常规体外受精-胚胎移植(IVF-ET)周期为5～6 d的新鲜正常囊胚8枚，置于玻璃化冷冻后液氮罐中长期保存。Y-27632购自美国Stemgent公司，山羊抗小鼠IgG(H&L)(Alexa Fluor®488)、山羊小鼠IgG(H&L)多克隆二抗(Alexa Fluor®555)购自英国Abcam公司，SB 431542购自英国Tocris公司，ITS-X supplement、A83-01、VPA购买于日本Wako公司，β-estradiol购于德国Sigma公司，Anti-HLA-G购自美国MBL公司。

1.2 方法

1.2.1hTSCs的培养与细胞核型分析 hTSCs培养基由DMEM/F12(体积分数0.94)、β-硫基乙醇(0.1 mmol/L)、胎牛血清(体积分数0.20)、青霉素链霉素双抗(体积分数0.005)、牛血清白蛋白(体积分数0.03)、胰岛素-转铁蛋白-硒培养基补充剂(体积分数0.01)、维生素C(1.5 mg/L)、表皮细胞生长因子(50 μg/L)、CHIR99021(2 μmol/L)、A83-01(0.5 μmol/L)、Y27632(5 μmol/L)、SB431542(1 μmol/L)及VPA(0.8 mmol/L)共同配制而成。①hTSCs培养：囊胚解冻后置于囊胚培养液中再培养2 h，去除透明带，转移至hTSCs培养基中，培养至第6天获得第1代hTSCs，于体式镜下用显微切割针将贴壁生长组织切割成4～8块，接种于4孔培养皿中；培养至第14天得到第2代hTSCs，以TryPLE消化成单细胞，接种于3.5 cm培养皿中继续培养、传代、冻存，供后续试验使用。②细胞核型分析：选择处于指数增殖期且生长旺盛的第7代hTSCs，以秋水仙素处理后，拍照观察细胞核型。

1.2.2细胞免疫荧光技术检测hTSCs中转录因子活化蛋白2C(TFAP2C)、细胞角蛋白7(CK7)以及转录因子GATA结合蛋白3(GATA-3)的表达 以40 g/L多聚甲醛固定第8代hTSCs 15 min，再用3 g/L Triton X-100孵育透膜1 h；以体积分数0.10的FBS+体积分数0.03的BSA室温封闭0.5 h；然后分别加一抗(1∶200)、二抗(1∶1 000)，加入DAPI衬染细胞核后共聚焦显微镜观察拍照，随机选取100个hTSCs，计算荧光细胞数量，以百分比表示。

1.2.3实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测hTSCs中相关基因的表达 取第8、16代 hTSCs，分别采用 Trizol法提取总RNA，逆转录合成 cDNA，以此为模板进行RT-qPCR。根据试剂盒说明书配制反应体系，以U6作为内参照，每个样品分别设置3个复孔，实验重复进行3次。采用2-△△CT计算样本中TFAP2C、CK7、GATA-3以及TEA转录因子4(TEAD4)基因的相对表达水平。引物名称及其序列见表1。

表1 引物名称及其序列

1.2.4Transwell实验检测hTSCs侵袭能力 将第9代hTSCs以每孔2.5×104个细胞接种于Trasnwell上室，下室为hTSCs培养基(未分化组)，同时再将第9代hTSCs以每孔2.5×104个细胞接种于Trasnwell上室，下室为分化培养基(分化组)，分别培养2、4、6 d。分化培养基的配制方法为：DMEM/F12(体积分数0.90)、β-硫基乙醇(0.1 mmol/L)、青霉素链霉素双抗(体积分数0.005)、牛血清白蛋白(体积分数0.03)、胰岛素-转铁蛋白-硒培养基补充剂(体积分数0.01)、A83-01(7.5 μmol/L)、Y27632(2.5 μmol/L)、NRG1(100 mg/L，第3天撤掉)、KOSR(体积分数0.04，第6天撤掉)。分别以免疫荧光法检测两组hTSCs培养至第2、4、6天时穿过transwell微孔的细胞数量，以及穿过transwell微孔的细胞中胶质细胞缺失因子1(GCM1)的表达情况，计算表达GCM1的细胞比例。实验设6个复孔，每孔重复测量4次，结果取均值。

1.2.5hTSCs分化能力以及内分泌功能的检测按照培养基不同将第9代hTSCs设置为分化组(hTSCs培养基)与未分化组(分化培养基)，分别采用RT-qPCR技术检测两组细胞中CK7、多配体蛋白聚糖-1(SDC-1)、人绒毛膜促性腺激素(β-hCG)和整合素α5(ITGA5)基因的相对表达水平。实验设6个复孔，每孔重复测量4次，结果取均值。待两组第9代hTSCs细胞密度约达80%时，将1×105个细胞分别接种于hTSCs培养基与分化培养基中继续培养，使用全自动免疫检验系统检测两组培养第2～6天时培养基中雌二醇和孕酮的浓度。实验设8个复孔，每孔重复测量4次，结果取均值。

1.3 统计学分析

2 结 果

2.1 hTSCs细胞核型分析

8枚正常囊胚成功培养出4株hTSCs。对第7代hTSCs进行核型分析，结果显示为雌性(46，XX)3株，雄性(46，XY)1株，均具有正常细胞核型。

2.2 hTSCs中TFAP2C、CK7、GATA3检测结果

免疫荧光技术检测结果显示，95%以上第8、16代hTSCs均表达TFAP2C、CK7和GATA3(图1)。RT-qPCR检测结果显示，第8代hTSCs中CK7、GATA3、TFAP2C、TEAD4的相对表达量分别为0.41±0.11、0.15±0.03、0.16±0.08、0.03±0.11，第16代hTSCs中CK7、GATA3、TFAP2C、TEAD4的相对表达量分别为0.52±0.86、0.14±0.01、0.16±0.02、0.02±0.13，两代间各基因表达量比较差异无显著性(P>0.05)。

A：TFAP2C的表达情况，B：CK7的表达情况，C：GATA的表达情况，D：DAPI衬染细胞核，免疫荧光法，400倍

2.3 hTSCs侵袭能力检测结果

析因设计方差分析结果显示，时间、组别及时间组别的交互作用对穿过trasnswell微孔的细胞数量均存在有明显影响(F组别=316.37，F时间=414.64，F交互=19.29，P<0.05)；单独效应分析显示，随着培养时间的延长，两组穿过trasnswell微孔的细胞数量差异有显著性(F=255.81、178.12，P<0.05)；第2、4、6天两组穿过trasnswell微孔的细胞数量比较差异具有显著性(F=53.31～234.55、67.10，P<0.05)。析因设计方差分析表明，分组、时间及其交互作用对穿过trasnswell微孔的细胞表达GCM1的比例有显著影响(F分组=114.58，F时间=338.80，F交互=33.40，P<0.05)；单独效应分析显示，随着培养时间延长，两组穿过trasnswell微孔的细胞表达GCM1的比例差异具有显著性(F=288.92、83.28，P<0.05)，第4、6天两组差异有显著性(F=50.25、131.13，P<0.05)。见表2。

表2 分化组与未分化组hTSCs侵袭能力比较

2.4 hTSCs体外分化能力及内分泌功能检测结果

RT-qPCR的检测结果显示，未分化组中CK7、SDC-1、β-hCG和ITGA5表达水平分别为9.2±2.3、7.1±1.4、34.4±3.2和27.2±1.9，分化组CK7、SDC-1、β-hCG和ITGA5表达水平分别为15.1±5.2、13.2±2.4、62.1±4.2和32.2±3.4。与未分化组相比较，分化组中各基因的表达水平均显著升高(t=-6.78～-2.51，P<0.05)。析因设计方差分析结果显示，分组、时间及其交互作用均对培养基中雌二醇的浓度具有显著影响(F分组=387.87，F时间=33.68，F交互=17.56，P<0.05)；单独效应分析显示，随着培养时间的延长两组培养基中雌二醇的浓度差异有显著性(F=42.03、9.21，P<0.05)，第2、4、6天两组培养基中雌二醇的浓度比较差异均具有显著性(F=43.68～210.18，P<0.05)。析因设计方差分析结果显示，分组、时间及其交互作用均对培养基中孕酮的浓度有显著影响(F分组=637.87，F时间=71.31，F交互=17.56，P<0.05))；单独效应分析显示，随着培养时间的延长两组培养基中孕酮的浓度比较差异有显著性(F=87.66、125.32，P<0.05)，第2、4、6天分两组培养基中孕酮的浓度比较差异均具有显著性(F=25.06～225.62，P<0.05)。见表3。

表3 分化组与未分化组hTSCs内分泌功能检测结果

3 讨 论

TB在人类囊胚植入、胎盘形成以及妊娠维持过程中起到非常重要的作用,妊娠早期TB的异常分化会导致胎盘相关并发症发生[15-16]。然而，受伦理和技术方面的限制，临床中要想获得足够数量的早期妊娠原代TB非常困难。目前关于小鼠TB发育机制的研究取得了一定的进展，但人和小鼠的胎盘形成存在差异。因此，迫切需要一种可靠、稳定的可用于体外研究的人类TB[5,17]。

本研究中，使用8枚正常囊胚成功培养出4株hTSCs，对第7代hTSCs进行细胞核型分析，结果显示为雌性(46，XX)3株，雄性(46，XY)1株，均具有正常核型。研究显示，mTSCs的形成和肿瘤坏死因子-β(TGF-β)、成纤维生长因子(FGF)信号通路有关，而hTSCs的形成则和Wing-less/Integrated(Wnt)、表皮细胞生长因子(EGF)信号通路有关，因此无法直接套用小鼠的培养体系获取hTSCs。本研究预实验期间首先使用小鼠的mTSCs培养体系获取hTSCs，细胞呈现克隆样生长，表达TB标记物并且可以稳定传代。当更换为hTSCs的培养体系后，hTSCs呈现纤维细胞样上皮形态，仍然可以稳定表达TB标记物并且稳定传代。此现象能够表明hTSCs的细胞内既存在TGF-β、FGF信号通路，也存在WNT、EGF信号通路，具体的信号调节通路仍待进一步探究。

先前的研究显示，TFAP2C、GATA3、CK7等为hTSCs特有标记物[18]。本研究免疫荧光显示95%以上第8、16代hTSCs能够表达TFAP2C、CK7以及GATA3；RT-qPCR技术检测结果则显示，CK7、GATA3、TFAP2C、TEAD4基因的相对表达量分别在两代中无显著性的差异。免疫荧光技术以及RT-qPCR技术检测结果显示，本研究培养获得的细胞均表达以上标记物，并且随着培养时间延长，表达稳定，因此可鉴定为hTSCs细胞。目前，许多细胞系，包括绒毛膜癌细胞系、永生化细胞系和BMP4处理的人胚胎干细胞(ESC)等，均已被用作TB细胞的模型。然而此类永生化细胞系(如HTR8/SVneo)和BMP4处理的人类ESC均不符合LEE等[19]于2016年提出的hTSCs标记物鉴定标准。一些绒毛膜癌细胞系虽然符合上述标准，但它们的转录组谱被认为与原代TB的转录组谱截然不同。而通过激活Wnt、EGF信号通路，并抑制TGF-β、组蛋白脱乙酰化酶、Rho相关蛋白激酶信号通路，可从人类妊娠早期的绒毛组织获得具有分化为三种主要TB的细胞株，将其命名为TSCT细胞，与此同时通过该培养体系也可以从人类囊胚培养获得与TSCT细胞相似的细胞株，将其命名为TSblast细胞，该细胞的分子特征、转录水平及分泌功能与妊娠早期胎盘滋养细胞相似[13-14]。但本团队按照上述培养方法进行了预实验，均无法培养获得hTSCs，在综合分析了以上研究的培养方案后，又根据我院实验室前期的工作基础对培养方法进行了改进和探索。

本研究Trasnswell结果显示，随着培养时间的延长，分化组第2、4、6天穿过trasnswell微孔的细胞数量均多于未分化组，表明与未分化组相比，分化组具有更强的侵袭能力。GCM1是一种胎盘特异性转录因子，在CTB、ST和EVT中均有表达[20-21],GCM1通过调节相关蛋白表达来介导TB融合和侵袭[22-23]。因此，GCM1对胎盘细胞分化和侵袭至关重要。本研究中，第2天分化组与未分化组中穿过trasnswell微孔的细胞表达GCM1比例无显著统计学差异，第4、6天分化组均显著高于未分化组，表明随着培养时间延长，分化组hTSCs中的GCM1表达比例显著高于未分化组，与体内胎盘发育规律相一致。

胎盘作为内分泌器官，将激素分泌到母体和胎儿循环中，从而影响妊娠结局[24]。ST是正常妊娠所需的关键激素，如人绒毛膜促性腺激素(hCG)和胎盘催乳素[25]、雌二醇、孕酮、神经递质以及抑制素等[19]。hCG是一种由α亚单位和β亚单位组成的二聚体，由CGB基因编码。hCG在刺激孕酮生成中起着关键作用，是反应妊娠发生的重要检测指标，本研究所收集的培养基上清液中hCG浓度低于我院检验科仪器的最低检测浓度，故本研究没有对该指标进行检测，对培养基中雌二醇和孕酮的浓度进行检测，结果显示分化组第2、4、6天培养基当中雌二醇、孕酮浓度均高于未分化组，符合胚胎着床时期激素分泌规律。

综上所述，本研究培养获得的hTSCs具有正常核型，免疫荧光技术以及RT-qPCR技术检测结果显示，hTSCs均表达hTSCs特有标记物，侵袭能力、分化能力、分泌功能等方面的检测结果也显示与体内TB相似，证明培养成功，所构建的培养体系适合hTSCs生长，这将为进一步研究人类TB的发育和功能提供有力的工具。

利益冲突声明：所有作者声明不存在利益冲突。

ConflictsofInterest：All authors disclose no relevant conflicts of interest.

伦理批准和知情同意：本研究涉及的所有试验均已通过临沂市妇幼保健院科学伦理委员会的审核批准(文件号：KYL-YXLL-2021014)。所有试验过程均遵照《人体医学研究的伦理准则》的条例进行。受试对象或其亲属已经签署知情同意书。

EthicsApprovalandPatientConsent：All experimental protocols in this study were reviewed and approved by The Sicentific Ethics Committee of Linyi Maternal and Child Healthcare Hospital(Approval Letter No.KYL-YXLL-2021014), and all experimental protocols were carried out by following The Ethical Guidelines for Human Medical Research.Consent letters have been signed by the research participants or their relatives.

作者贡献：陈娟、马征来、卢永收、潘文霞、武传叶、孙美英和李超均参与了研究设计以及论文的写作和修改。所有作者均阅读并同意发表该论文。

Contributions：CHENJuan,MAZhenglai,LUYongshou,PANWenxia,WUChuanye,SUNMeiying, andLIChaoall participated in the research design, as well as the writing and revision of the paper.All the authors have read the last version of the paper and consented submission.