烟嘧磺隆对甜玉米糖酵解和三羧酸循环途径中关键物质的影响

蒙彦宇， 王 健， 李 云， 韩金玲， 韩玉翠， 杨 敏， 林小虎， 周印富

(河北科技师范学院，河北秦皇岛 066004)

甜玉米(ZeamaysL. ssp.saccharataSturt)有水果玉米、蔬菜玉米之称，具有广阔的市场前景。为了迎合市场需求，玉米的品种选育逐渐向籽粒含高糖量方向发展，而甜玉米籽粒的高含糖量会降低种子活力，导致群体冠层生长发育缓慢，无法应对田间日益激烈的杂草竞争[1]。

因此，使用除草剂控制田间杂草是甜玉米生产的必然选择。烟嘧磺隆是一种磺酰脲类内吸传导型除草剂，常用于玉米田苗后杂草控制[2]。烟嘧磺隆的选择性除草作用机制是基于玉米、杂草对其代谢的差异实现的。在烟嘧磺隆胁迫下，受害严重的玉米幼苗可出现大面积失绿、矮化、畸形，甚至死亡[3-4]。近几年来，烟嘧磺隆得到广泛使用，但其在甜玉米上应用的安全性还未得到全面验证。

糖酵解是生物体取得能量的主要方式，其途径是将葡萄糖、糖原降解为丙酮酸，生成的丙酮酸进入线粒体，通过三羧酸循环(TCA)途径及电子传递链彻底氧化成二氧化碳和水，并生成三磷酸腺苷(ATP)[5-6]。任晓松等研究发现，低温胁迫会降低玉米种子的糖酵解、TCA途径和磷酸戊糖途径的转运效率[7]。薛梅真等研究发现，人工老化处理使己糖激酶(HK)活性升高，ATP含量降低，最终会影响玉米种子的发芽率[8]。Hao等研究发现，干旱胁迫条件会导致玉米根部糖类物质和相关酶的基因表达量发生改变[9]。

糖代谢途径是植物获取能量的主要方式，关于逆境胁迫对植物体内糖酵解和TCA途径的影响已被广泛报道[10-11]，但是关于烟嘧磺隆胁迫对甜玉米植株体内糖酵解、TCA途径的影响则鲜有报道。本研究的前期结果表明，烟嘧磺隆胁迫导致敏感性甜玉米HK320的光合特性值、叶绿素荧光参数显著降低，PSⅡ反应中心失活，C4途径代谢活动下降，将影响甜玉米体内的物质合成和积累[12-13]。在此研究基础上，本研究继续从糖酵解、TCA途径角度解析烟嘧磺隆胁迫下甜玉米的耐药生理机制，以期为减缓苗后除草剂对甜玉米的毒害作用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料和药剂

供试材料为河北科技师范学院选育的1对对烟嘧磺隆表现出耐药差异的甜玉米姊妹系，分别为耐药性甜玉米自交系HK301、敏感性甜玉米自交系HK320。

试验药剂为日本石原产业株式会社生产的 40 g/L 烟嘧磺隆可分散油悬浮剂。

1.2 试验设计

试验开始于2018年，在河北科技师范学院昌黎试验站进行。前期除草剂浓度的筛选试验结果表明，在玉米苗4叶1心期，当喷施药剂浓度为 36 mg/hm2时，HK301可以正常生长，HK320最终死亡[3]。因此，后续试验选择36 g/hm2作为田间喷施烟嘧磺隆的浓度。

2020—2021年在河北科技师范学院昌黎试验站进行大田试验。大田试验采用随机区组设计，小区面积为38.4 m2，设3次技术重复。设置药剂喷施浓度为36 g/hm2，以喷施清水作为对照。在玉米4叶1心期时喷药，分别在喷药后1、3、5、7 d采集不同处理的叶片样品置于液氮中，保存于-80 ℃冰箱中，用于葡萄糖(GLU)、丙酮酸(PA)、柠檬酸(CA)、草酰乙酸(OAA)、苹果酸(MDH)、三磷酸腺苷(ATP)和6-磷酸葡萄糖(6PG)含量(以鲜质量计)的测定与己糖激酶(HK)、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)活性(以鲜质量计)的测定。

1.3 测定项目与方法

参照李圆圆的方法[14]进行GLU含量的测定；参照Braithwaite等[15]、Martinez-Barajas等的方法[16]进行HK活性的测定；参照Gonzalez等的方法[17-18]进行PEPC活性的测定；参照孟德义的方法[19]进行PA含量的测定；参照Yang等的方法[20]进行CA含量的测定；参照崔晓慧的方法[21]进行OAA含量的测定；参照尹志梅等的方法[22]进行MDH含量的测定；参照应汉杰等的研究方法[23]进行6PG含量的测定；参照刘俊芳等的方法[24]进行ATP含量的测定。

1.4 数据处理

采用 Excel 2007和SigmaPlot 12.5进行数据处理与作图，用SPSS 22.0进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 烟嘧磺隆对甜玉米糖酵解途径的影响

2.1.1 烟嘧磺隆对甜玉米中葡萄糖含量的影响 由图1可知，在烟嘧磺隆胁迫处理下，HK301的GLU含量呈先上升后下降的趋势，在用烟嘧磺隆胁迫处理5 d后达到最大值。用烟嘧磺隆胁迫处理 3 d 后，HK301的GLU含量较对照(HK301-CK)增加41.62%，差异达到显著水平(P<0.05)。在烟嘧磺隆胁迫处理下，HK320的GLU含量呈持续上升的趋势。用烟嘧磺隆胁迫处理1、3 d后，HK320的GLU含量与对照(HK320-CK)相比没有显著差异；用烟嘧磺隆胁迫处理5、7 d后，HK320的GLU含量分别较对照(HK320-CK)增加了21.56%、22.80%，差异达到显著水平(P<0.05)。对2个自交系甜玉米的GLU含量进行比较发现，用烟嘧磺隆胁迫处理1、7 d后，HK301的GLU含量分别较HK320低46.27%、62.80%，并且差异达到显著水平(P<0.05)。

2.1.2 烟嘧磺隆对甜玉米中6-磷酸葡萄糖含量的影响 由图2可知，烟嘧磺隆胁迫处理显著提高了HK301、HK320的6PG含量。在烟嘧磺隆胁迫处理1、3、5、7 d，HK301的6PG含量分别较对照(HK301-CK)增加了52.04%、64.07%、72.69%、50.19%，并且差异显著。用烟嘧磺隆胁迫处理1、3 d 后，HK320的6PG含量与对照(HK320-CK)间没有显著差异，用烟嘧磺隆胁迫处理5、7 d后，HK320的6PG含量分别比对照(HK320-CK)增加了48.77%、59.37%，差异达到显著水平(P<0.05)。

2.1.3 烟嘧磺隆对甜玉米中丙酮酸含量的影响 由图3可知，在烟嘧磺隆胁迫处理下，HK301的PA含量较对照显著增加。在喷药后1、3、5、7 d，HK301的PA含量分别比对照(HK301-CK)增加了36.78%、29.67%、46.87%、26.22%，差异达到显著水平(P<0.05)。用烟嘧磺隆胁迫处理1、3、7 d后，HK320的PA含量分别较对照(HK320-CK)增加了30.80%、22.92%、27.37%，差异达到显著水平(P<0.05)。用烟嘧磺隆胁迫处理5 d后，PA含量较对照(HK320-CK)显著降低了21.35%。

2.1.4 烟嘧磺隆对甜玉米中己糖激酶活性的影响 由图4可知，随着烟嘧磺隆胁迫处理时间的延长，HK301的HK活性呈上升趋势。用烟嘧磺隆胁迫处理1、3、5、7 d后，HK301的HK活性与对照(HK301-CK)相比分别增加了54.66%、55.48%、67.22%、17.83%(P<0.05)，并且差异显著。随着烟嘧磺隆胁迫时间的增加，HK320的HK活性总体呈先上升后下降的趋势。用烟嘧磺隆胁迫处理1、3、5、7 d后，HK320的HK活性分别较对照(HK320-CK)增加了51.07%、49.84%、51.06%、72.64%，差异达到显著水平(P<0.05)。烟嘧磺隆胁迫处理显著改变了2个自交系甜玉米的HK活性，用烟嘧磺隆处理1、3、5 d后，HK301的HK活性分别较HK320降低了64.18%、51.92%、82.56%。

2.1.5 烟嘧磺隆对甜玉米中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性的影响 由图5可知，用烟嘧磺隆胁迫处理5 d后，HK301的PEPC活性达到最大值，随后呈下降趋势。用烟嘧磺隆胁迫处理1、3、5、7 d后，HK301的PEPC活性分别较对照(HK301-CK)增加了0.17%、45.12%、62.42%、60.49%，差异达到显著水平(P<0.05)。在烟嘧磺隆胁迫处理下，HK320的PEPC活性呈持续下降的趋势。用烟嘧磺隆胁迫处理1 d后，HK320的PEPC活性与对照(HK320-CK)相比无显著变化，而用烟嘧磺隆胁迫3、5、7 d后，HK320的PEPC活性分别较对照(HK320-CK)减少了30.04%、50.57%、67.35%，差异达到显著水平(P<0.05)。随着烟嘧磺隆胁迫处理时间的延长，2个自交系甜玉米的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性间的差异显著。在各个时间点，HK301的PEPC活性分别较HK320高38.81%、56.86%、80.31%、82.18%，差异达显著水平(P<0.05)。

2.2 烟嘧磺隆对甜玉米三羧酸途径的影响

2.2.1 烟嘧磺隆对甜玉米中苹果酸含量的影响 由图6可知，2个自交系的MDH含量均在喷药后 1 d 达到最大值，随后呈下降趋势，并且HK320的下降速率更大。在烟嘧磺隆胁迫处理1、3、5、7 d后，HK301的MDH含量分别较对照(HK301-CK)增加了67.06%、44.35%、28.02%、14.77%，差异达到显著水平(P<0.05)。除喷药后1 d，喷药后3、5、7 d，HK320的MDH含量分别较对照(HK320-CK)显著减少22.89%、53.41%、71.08%。喷药后HK301、HK320的MDH含量呈现相同的趋势，但HK301分别比HK320高28.24%、56.79%、66.61%、73.72%，差异显著。

2.2.2 烟嘧磺隆对甜玉米中草酰乙酸含量的影响 由图7可知，随着喷药天数的增加，2个自交系的OAA含量呈现不同的变化趋势。烟嘧磺隆胁迫处理显著增加了HK301的OAA含量，并且在胁迫后 1 d 达到最大值。用烟嘧磺隆胁迫处理1、3、5、7 d后，HK301的OAA含量分别较对照(HK301-CK)增加了40.74%、38.46%、37.50%、36.00%，差异达到显著水平(P<0.05)。在烟嘧磺隆胁迫处理下，HK320的OAA含量呈先上升后逐渐下降的趋势。用烟嘧磺隆胁迫处理1、3、5 d后，HK320的OAA含量分别较对照(HK320-CK)增加了24.99%、30.04%、15.61%，用烟嘧磺隆胁迫处理7 d后，HK320的OAA含量比对照(HK320-CK)低12.11%，并且差异达到显著水平(P<0.05)。对比2个自交系的OAA含量可知，在喷药后的各个时间点，HK301的OAA含量分别比HK320高18.76%、16.01%、21.50%、47.60%，差异达到显著水平(P<0.05)。

2.2.3 烟嘧磺隆对甜玉米中柠檬酸含量的影响 由图8可知，在烟嘧磺隆胁迫处理下，随着时间的增加，HK301的CA含量呈先下降后上升的趋势，并且在胁迫后1 d达到最小值。在烟嘧磺隆胁迫处理 1 d 后，CA含量比对照(HK301-CK)低41.49%，并且差异显著；用烟嘧磺隆胁迫处理7 d后，HK301的CA含量比对照(HK301-CK)高43%，差异达到显著水平(P<0.05)。在烟嘧磺隆胁迫处理下，HK320的CA含量呈持续上升的趋势。用烟嘧磺隆胁迫处理1、3、5、7 d后，HK320的CA含量分别较对照(HK320-CK)增加了58.73%、35.78%、44.52%、43.79%，差异达到显著水平(P<0.05)。用烟嘧磺隆胁迫处理7 d后，HK301的CA含量比HK320高34.53%，并且差异显著。

2.2.4 烟嘧磺隆对甜玉米三磷酸腺苷的影响 由图9可知，用烟嘧磺隆处理后，HK301的ATP含量呈先上升后缓慢下降的趋势。用烟嘧磺隆胁迫处理1、3 d后，HK301的ATP含量分别较对照(HK301-CK)增加了36.87%、58.00%，并且差异达到显著水平(P<0.05)。用烟嘧磺隆胁迫处理5、7 d后，HK301的ATP含量与对照(HK301-CK)相比未有显著改变。用烟嘧磺隆处理后，HK320的ATP含量在烟嘧磺隆胁迫处理1、3 d后呈上升趋势，但HK320的ATP含量与对照间无显著差异，用烟嘧磺隆胁迫处理5、7 d后，HK320的ATP含量突然下降，与对照(HK320-CK)的ATP含量相比，分别显著减少57.45%、63.67%。用烟嘧磺隆胁迫后的1、3、5、7 d，2个自交系的ATP含量都有下降趋势，并且HK301的ATP含量分别比HK320高36.16%、23.66%、76.23%、72.57%。

3 讨论与结论

笔者的前期研究结果表明，在烟嘧磺隆胁迫下，相较于耐药性甜玉米自交系HK301，敏感性甜玉米自交系HK320的净光合速率、气孔导度显著下降，说明烟嘧磺隆胁迫会影响玉米的光合特性，进而导致其物质积累和呼吸速率发生变化[25]。本研究从糖酵解和TCA途径的角度进一步探讨烟嘧磺隆胁迫对甜玉米自交系呼吸代谢、物质消耗的影响，解析甜玉米对烟嘧磺隆的耐药性。

糖酵解途径存在于生物体内，可为生命活动提供能量[26]。HK是糖酵解途径的限速酶，是六碳糖进入糖酵解途径的关键酶[27-28]。GLU通过HK形成6PG，随后6PG经过一系列反应形成PA[29]。本研究结果表明，相较于耐药性自交系HK301，HK320的GLU和6PG含量显著升高，HK的活性显著增强。说明受到烟嘧磺隆危害时，植物体内可能需要消耗更多糖分物质为机体提供能量，因此对烟嘧磺隆越敏感的品种，其糖类物质含量升高得越快。谢美华等研究发现，干旱胁迫下玉米幼苗叶片的可溶性糖含量随着胁迫天数的增加而增加[30]。本研究结果与前人研究结果一致，即PEPC在PEPC酶作用下形成OAA[31]。本研究结果表明，在烟嘧磺隆胁迫下，相较于HK301，HK320的PEPC活性显著降低，表明烟嘧磺隆胁迫会影响植物糖酵解的最终产物含量。郭书奎等研究发现，在NaCl胁迫下，玉米幼苗的PEPC活性显著降低[32]。在烟嘧磺隆胁迫下，敏感性甜玉米PEPC活性的降低可能导致糖酵解途径物质积累过多。

TCA途径是在有氧条件下，EMP的最终产物PA进入线粒体，形成CO2、H2O的过程[33]。MDH酶是TCA途径的关键酶，它催化苹果酸脱氢生成OAA、NADH，是TCA途径反应的最后一步，可以反映TCA途径的活化程度[34-35]。本研究结果表明，在烟嘧磺隆胁迫下，2种自交系甜玉米中敏感性HK320的MDH含量随着胁迫时间的延长而显著降低。任淑娟的研究发现，MDH活性较高，表明有氧呼吸作用强，植物体内各种代谢活动旺盛[36]。由此可见，2种自交系甜玉米的TCA途径的活化程度受到除草剂影响且呈下降趋势。本研究结果表明，在烟嘧磺隆胁迫下，HK301、HK320与对照(HK301-CK和HK320-CK)相比OAA、CA含量显著升高。黄爱缨等研究发现，在低磷胁迫下，玉米自交系苗期根部的OAA、CA含量显著增多[37]。本研究结果与前人研究结果一致。Samanta等研究发现，水稻在砷胁迫下呼吸代谢代表性有机酸和酶受到调节[38]。在烟嘧磺隆胁迫下，相较于HK301，HK320的ATP含量显著降低。段乃彬等研究发现，在低温胁迫下，玉米种子的ATP含量明显降低[39]。由此可见，苗后除草剂会影响甜玉米的TCA途径的正常代谢速率，导致植株生长减缓，甚至死亡。

在烟嘧磺隆胁迫下，相较于耐药性自交系HK301，敏感性自交系HK320的糖类物质(GLU、6PG)积累加快，呼吸代谢的关键物质(PA、OAA、MDH、CA、ATP)含量及关键酶(PEPC)活性显著降低。研究发现，烟嘧磺隆胁迫影响不同耐药性甜玉米的糖代谢程度。本研究结果将为解决烟嘧磺隆除草剂对甜玉米的糖代谢途径的毒害作用、提高甜玉米对烟嘧磺隆耐药性提供理论依据。