氮肥减量配施生物炭对玉米根系生理及氮素去向的影响

李海珀， 水清明， 贾 莉

(1.甘肃省定西市种子站，甘肃定西 743000； 2.甘肃省定西市农业科学研究院，甘肃定西 743000；3.甘肃省定西市农业技术推广站，甘肃定西 743000)

氮是植物体内核糖核酸、蛋白质、酶及激素的重要组成成分，在植物生长发育及生理代谢中具有不可替代的作用[1]。农业生产中，施用氮肥是保障农作物品质及产量的必要措施，然而施氮量与产量间具有一定阈值[2]，增加氮施用量可在一定程度上提高植株氮素含量，但氮素在主要营养器官中的再分配效率可能会因此减少，当施氮量过高时产量显著降低[3]。目前，氮肥不适当施用带来的负面影响日趋严重，如何有效降低氮肥使用量，提高作物氮利用率已成为发展可持续性农业的重要问题[4]。为提高作物氮肥利用率，已经开展了作物育种、缓释控释技术以及均衡施肥等多种策略[5]，取得了良好的生产效果，但优化氮素管理实践，仍是一个亟待探索的过程。

1 材料与方法

1.1 供试地点与供试材料

试验于2021年5—7月于甘肃省定西市农业科学研究院温室大棚中进行。供试玉米品种为隆丰211，是甘肃省目前主栽的优良品种之一，使用5%次氯酸钠表面消毒并暗处理催芽24 h。

供试氮肥为15N-尿素(δ15N=11.28%)，来自上海化工研究院。生物炭购自南京勤丰众成生物质新材料有限公司，由玉米秸秆经过450 ℃无氧环境下热解2 h炭化制成，pH值为8.65，生物炭中C、H、O元素的质量分数分别为66.74%、1.17%、12.53%，容重为0.28 g/cm3，比表面积为9.12 m2/g，主要官能团为羟基、烷烃和酰胺基。

供试土壤取自甘肃省定西市农业科学研究院内(35°34′59″N，104°36′18″E)0～20 cm表层土壤。土壤类型为重壤土。土壤理化性质为含有机质 12.94 g/kg，全氮0.87 g/kg、碱解氮52.75 mg/kg，有效磷11.84 mg/kg，速效钾103.36 mg/kg。

1.2 试验设计

试验设置2因素3水平完全随机组合设计，因素1：施用生物炭(BC)，设置施用0%、3%、6%等3个生物炭水平，分别记为BC0、BC3、BC6；因素2：氮素水平(N)，在常规施肥基础上设置100%、80%、60%等3个氮素水平，分别记为N100、N80、N60；共设置9个处理组合。其中施用生物炭处理的0%、3%、6%为施用质量与培养土壤质量之比，施用氮素处理的100%、80%、60%为与常规施氮量(225 kg/hm2)的质量之比，即N100、N80、N60施氮量分别为3.0、2.4、1.8 g/盆。各处理重复3次。

盆栽装置为聚乙烯塑料桶，盆高21 cm，上口径17.5 cm，底径14 cm。每盆装土4 kg。将上述生物炭(BC)与施氮(N)处理称取相应质量与土壤充分搅拌均匀后装盆，其中每盆纯磷施入量为1.0 g(mP2O5∶mK2O=1.0 ∶1.5)。每盆施入催芽的玉米种子3粒，保持70%土壤持水量。培养期间，每1周转动盆体1次，同时每2周随机挪动盆体位置1次，以消除光照、通风等因素造成的试验误差。试验共培育40 d。

1.3 样品采集及测定分析

1.3.1 玉米植株相关氮指标、土壤氮测定 培养结束后，将植物地上部、根系分离，65 ℃烘干并称质量以确定植株干物质含量。在测定15N丰度和总N含量之前，将植物样品和风干土壤样品细磨并通过0.15 mm网筛，植物和土壤15N同位素比采用稳定同位素比质谱仪(DELTA plus XP，美国Thermo Finnigan公司)测定。

1.3.2 玉米根系性状及根系活性特征测定 盆栽结束后将盆体剖开，采用自来水小心清洗以获得完整根系，采用EPSON Perfective V720 photo扫描仪对根系进行扫描，WinRHIZO系统(Regent Instruments LA2000)分析根系体积、总根长、根系表面积及根系平均直径。重复3次。根系活力采用氯化三苯基四氮唑法(TTC)测定[15]；采用甲烯蓝吸附法测定玉米根系总吸收表面积、根系活跃吸收表面积[15]，比表面积为活跃吸收表面积与总吸收表面积之比。

1.3.3 氮素相关代谢基因表达分析 使用TRIpure Reagent Plant RNA Mini Kit(北京百泰克生物技术有限公司)试剂盒提取地上部、根系总RNA，使用高容量cDNA逆转录试剂盒(HiScript® Ⅱ QRT SuperMix，南京诺唯赞生物科技股份有限公司)按照试剂盒合成第1条cDNA。以ZmUBC为看家基因，采用StepOnePlusTM Real-Time PCR系统(赛默飞世尔科技公司)对cDNA进行qRT-PCR分析。氮素相关代谢基因(ZmAS1、ZmGS1)的特异性引物序列见表1。反应体系：2×10 μL SYBR Premix ExTaqⅡ、1.0 μL正向引物、1.0 μL反向引物、2.0 μL cDNA和10 μL ddH2O。扩增条件为：95 ℃预变性10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72.0 ℃ 30 s，40个PCR循环。借助RQ Manager(ThermoFisher Scientific，USA)采用2-ΔΔCT断层扫描方法分析数据。

1.4 数据处理与统计分析

来自15N标记尿素的氮素(Ndff)、土壤氮素残留以及植物氮素利用率(NRE)由下式计算[16]：

玉米各器官Ndff=玉米各器官15N原子百分超/15N-尿素原子百分超×100%；土壤Ndff=土壤的15N原子百分超/15N-尿素原子百分超×100%；

表1 qRT-PCR引物序列信息

NRE=玉米干质量×植株N浓度(%)×玉米整株Ndff/施氮量×100%；

标记土壤残留率=土壤总干质量×土壤全N×土壤Ndff/施氮量×100%；

标记氮肥损失率=100%-NRE-土壤氮肥残留率。

采用进行双因素方差分析和最小显著法(LSD)进行试验数据统计分析(α=0.05)，采用Origin 2018进行绘图。

2 结果与分析

2.1 氮肥减量配施生物炭对玉米根系氮组分及干物质累积的影响

表2 氮肥减量配施生物炭对玉米根系矿质氮组分及根系干物质含量的影响

2.2 氮肥减量配施生物炭对玉米根系性状的影响

由图1-a可知，总根长指标中，不同生物炭处理下其氮肥施用水平处理表现不一，就生物炭水平而言，以BC3、BC6处理大于BC0处理；就氮素减施水平而言，整体以N100、N80处理大于N60处理，其中N80处理在任一生物炭施用水平处理中皆显著大于N60处理。由图1-b可知，根系表面积中，就同一氮素施用水平处理中，均以BC3、BC6处理显著大于BC0处理；整体而言，以BC3N100处理最大，其他处理较其降低1.32%～63.22%，其中显著大于BC0N100、BC0N80、BC0N60、BC3N80、BC3N60处理。由图1-c可知，根系体积指标中，就氮素施用水平处理而言，整体以N60处理显著小于其他氮肥施用水平处理，其中在BC0、BC3、BC6水平下较N100处理分别显著降低49.14%、35.92%、49.06%；整体而言，以BC6N80处理最高，其他处理较其降低4.86%～61.51%。由图1-d可知，根系平均直径指标中，任一氮素水平下，随着生物炭施用水平的提高其平均直径均相应增加，且皆以N100处理较大，BC0、BC3、BC6水平下其平均直径分别为2.73、2.74、2.86 mm，上述生物炭水平下N60较N100处理相应分别显著降低23.44%、21.53%、24.83%。

2.3 氮肥减量配施生物炭对玉米根系活性特征的影响

由图2-a可知，根系活力指标中，就氮素施用水平处理而言，整体以N60处理显著小于其他氮肥施用水平处理，BC0处理下，N100、N80、N60处理间均差异显著，而在BC3、BC6处理水平下，以N100处理较大但与N80处理未达显著水平，在BC0、BC3、BC6水平下较N100处理分别显著降低72.89%、22.03%、19.43%；整体而言，以BC6N100处理最高，其他处理较其降低2.43%～75.30%。由图2-b可知，在根系总吸收表面积中，就生物炭施用水平而言，BC0处理下氮素施用处理间均差异显著，BC3、BC6处理水平下则均无显著差异。由图2-c可知，在根系活跃吸收表面积中，以BC6N80处理最高，其他处理较其降低9.53%～77.28%，除与BC3N100、BC6N100处理无显著差异外，皆显著大于其他处理。比表面积为总根系表面积与活跃表面积之比，由图2-d可知，总体而言，以BC6N100处理比表面积值最高，与BC3N100、BC6N80无显著差异外，均显著大于其他处理。

2.4 氮肥减量配施生物炭对玉米根系氮素代谢基因表达影响

植物中的氮代谢过程已被证明是多种相互依赖的途径，其中涉及许多基因，包含一系列蛋白质、酶和代谢物。其中，谷氨酰胺合成酶(GS)和天冬酰胺合成酶(AS)被认为在植物氮代谢过程中具有重要作用。由图3-a可知，在ZmGS1中，以在BC6N100处理转录水平最高，其次为BC3N100、BC0N100处理，三者无显著差异外均显著高于其他处理，而BC0N80、BC0N60处理差异显著且均显著低于其他处理。在ZmAS1中(图3-b)，以BC6N80处理相对表达水平最高，余下处理较其降低16.14%～85.82%，其中与BC6N100处理无显著差异外皆显著大于其他处理。此外，在添加BC条件下，ZmGS1基因的相对表达丰度整体比ZmAS1基因更高，这意味着在添加BC的代谢调整过程中，ZmGS1基因可能比ZmAS1基因更敏感。

2.5 氮肥减量配施生物炭对15N标记氮肥去向的影响

由表3可知，在不添加生物炭(BC0)处理中，随着减氮水平增加，玉米地上部的氮利用率下降，而玉米根部的N利用率增加。在添加生物炭(BC3、BC6)处理中，玉米地上部的氮肥利用率随着减氮水平的增加而增加，这与各处理在根系中呈相反趋势。就生物炭处理(BC3、BC6)而言，与不添加生物炭处理(BC0)相比，在3%比例的生物炭处理(BC3)中，玉米地上部利用率、根系利用率及土壤残留率增加、损失率降低，以添加6%比例的生物炭处理(BC6)具有最高的土壤残留氮和最低的氮损失率。在玉米整株的氮肥利用率中，当添加6%生物炭且施氮肥施用比例为80%时(BC6N80)，玉米植株的氮素利用率(NRE)最高，为29.42%；其他处理较其显著降低7.65%～33.07%，损失率则显著增加19.46%～153.69%。双因素方差分析中，BC×N对根系氮肥利用率、整株氮肥利用率及氮肥损失率均存在显著交互作用。

表3 氮肥减量配施生物炭下15N-尿素去向 %

3 讨论与结论

根系是植物获取养分及水分资源的主要器官，根系性状(构型)是反映植物根系生长的重要表征，发达的根系则意味着可最大化获取土壤资源[11]。根系活性是根系生理代谢的重要体现，根系活性越高，表明碳水化合物及酶代谢越旺盛，资源获取能力越强[21]。本研究中，未施用生物炭处理(BC0)下，随着氮肥减施水平增加，玉米根系性状(体积、总根长、表面积、平均直径)和根系活性生理(根系活力、总吸收表面积、活跃吸收表面积、比表面积)均呈下降趋势，表明氮肥减施不利于根系生长发育。这与前人研究结论[16]基本不一致，该研究表明常规施肥减氮20%条件下对烤烟根系生理影响不大，这可能是由于二者供试土壤养分水平差异过大的缘故。研究表明，作物植株中60%以上的养分资源来源于土壤，仅35%作用来源于外源施肥[22]，本研究供试土壤较为贫瘠，因此氮肥减施会直接影响玉米植物的生长发育。就BC施用水平而言，随着施用水平增加其玉米根系性状及根系活性指标整体呈增加趋势，表明6%的生物炭施用比例效果较好，且6%的生物炭施用比例下，N100处理与N80处理根系发育差异最小，表明常规施氮减氮20%条件下，施用较高比例的生物炭可保证玉米植株根系发育。

在高等植物中，天冬酰胺合成酶(AS)负责氨同化的第一步，谷氨酰胺合成酶(GS)则参与后续氨的转化、储存与运输[23]。在植物的氮再利用阶段，AS与GS共同作用于运输含氮分子，催化谷氨酰胺和天冬氨酸形成天冬酰胺，该过程对于逆境下的氮循环至关重要[24]。在本研究中，观察到玉米根系中ZmGS1的表达受BC添加比例的影响较大，尤其在BC6处理中，这意味着添加6%的BC比例条件下ZmGS1基因在改善氨同化和增加氮再利用方面发挥着更为重要的作用。类似地，ZmAS1在根系中的表达受BC添加和氮减少的影响亦较大，但表达水平更低(图3-b)，这与先前对玉米根系的研究[13]一致，即AS活性在低氮胁迫下与铵同化循环相关的谷氨酰胺合酶和谷氨酰胺酮戊二酸氨基转移酶的转录水平较低[25]。

本研究中，BC0处理下，玉米植株的氮肥利用率(NRE)随着氮减施水平的增加而降低，在减少氮使用的基础上添加BC时可明显提高NRE(表1)。这一结果与Agegnehu等的结论[26]趋于一致：生物炭与化肥结合使用时可显著提高农作物的肥料利用效率，其中对提高NRE尤为显著。本研究中，玉米NRE在6% BC处理中显著高于其他生物炭施用比例处理，初步表明6%生物炭是较佳的施用比例，可能归因于适宜的生物炭施用量对土壤中氮动力学和氮循环过程的影响[8，27]。此外，在6% BC施用比例条件下，施氮80%水平处理(BC6N80)具有最高的NRE、土壤氮残留率以及最低的氮损失率，再次表明80%减氮输入结合6%的生物炭添加比例具有较好的保肥性。