濒危藏药植物波棱瓜雌株的繁育技术研究

央金拉姆 尼珍* 鲁跃东 单增白玛

（1.西藏自治区高原生物研究所，西藏 拉萨 850000；2.南木林镇农牧综合服务中心，西藏 日喀则 857100）

波棱瓜（Herpetospermum peduculosum）为葫芦科，波棱瓜属一年生攀延草本植物。茎、枝纤细，有棱沟，初时具疏柔毛，最后变近光滑无毛。叶柄长4～8(-10)cm，具与茎枝一样的毛被，后渐脱落；叶片膜质，卵状心形，长6～12cm，宽4～9cm，先端尾状渐尖，边缘具细圆齿，或有不规则的角，基部心形，弯缺张开，宽、深均为1～2cm，两面粗糙，初时具黄褐色长柔毛，后渐脱落，叶脉在叶背隆起，具长柔毛；卷须2歧，近无毛。雌雄异株。雄花：通常为单生花同一总状花序并生，单生花花梗长达10～16cm，具5～10 朵花的总状花序，长达12～40cm，有疏柔毛；花梗长2～6cm，疏生长柔毛；花萼筒上部膨大成漏斗状，下部管状，长2～2.5cm，顶端直径8～9mm，基部径2mm，被短柔毛，裂片披针形，长8～9mm；花冠黄色，裂片椭圆形，急尖，长20～22mm，宽12～15mm；雄蕊花丝丝状，长2～3mm，花药长5～6mm；退化雌蕊近钻形，长4～5mm。果梗粗壮，长1～2cm；果实阔长圆形，三棱状，被长柔毛，成熟时3 瓣裂至近基部，里面纤维状，长7～8cm，宽3～4cm。种子淡灰色，长圆形，基部截形，具小尖头，顶端不明显3 裂，长约12mm，宽5mm，厚2～3mm。花果期6～10月［1］。

波棱瓜在西藏主要分布在波密、林芝、错那、聂拉木，吉隆、墨脱等地，经本课题组考察，其分布地点增加了4 个县。另据资料记载，国内主要分布在四川西部、云南西北部、青海。国外主要分布在尼泊尔、锡金、不丹及印度北部等地。从调查情况来看，波棱瓜分布在野外的比较少，大部分生长在农牧民家园的篱笆墙上。

随着进一步对波棱瓜的研究，发现该物种具有药用价值，波棱瓜种子含生物碱、鞣质、甾醇、氨基酸、三萜类［2］，其种子入药，有清热解毒、柔肝之功效，主要用于治疗黄疸型传染性肝炎以及消化不良等，是常用藏药材之一。主要生长在海拔1500～3500m 的温暖、湿润的亚热带路旁、山坡、灌丛、林缘,虽然分布范围较广，但在分布区植株密度低。随着藏医药的蓬勃发展，使波棱瓜野生资源濒临灭绝。2005年西藏自治区藏医药领域的专家们共同确定波棱瓜为一级濒危植物。在人工栽培中常用种子播种法，波棱瓜是雌雄异株植物，至今从其种子上无法辨认雌、雄株。在常规播种条件下，种子发芽率较低且雌株比例只占30%，因此，产量很低，造成了波棱瓜人工栽培的瓶颈，严重制约着规模化栽培。目前，有关波棱瓜组织培养方面见叶片愈伤诱导和顶芽诱导的报道，未见雌株繁殖方面的报道［3］，因此，研究波棱瓜雌株的繁殖技术具有非常重要的意义。本实验以濒危藏药植物——波棱瓜雌株的茎段为外植体进行再生植株的研究，已培养出大量的波棱瓜雌株组培苗并进行了炼苗、移栽、采收，为提高波棱瓜产量开辟了一条行之有效途径。

1 材料与方法

1.1 供试材料

采自西藏林芝地区八一镇西藏药业药材栽培基地的波棱瓜子，千粒重为70～110g。通过温室内播种、移栽，待开花可识别波棱瓜雌、雄株时，剪取波棱瓜雌株上端幼嫩叶片及茎段。先用肥皂水分别进行清洗再用流水反复冲洗，再放入75%的酒精中浸5s 后，用无菌水冲洗3遍，然后用0.1%升汞分三个时间段进行消毒，最后用无菌水清洗三遍以上待用。

1.2 培养条件与方法

实验以MS、N6为基础培养基，附加30 g／L蔗糖，6 g／L琼脂，0.1 g／L 肌醇，pH 5.8。

培养条件：培养温度为22℃±2；、每天照明12h，采用固体培养。

方法：准备好的材料在超净台用无菌滤纸吸干表面水分，将叶片剪切成5 mm×5mm 大小的方块；茎段切成长约2cm左右，分别接入培养基中。

2 结果与分析

2.1 实验材料分析

叶片、茎段分别接种到MS 培养基中，培养2d 后叶片开始向外卷曲.一周左右，叶片的四周均有愈伤组织生成。培养到20d 愈伤组织呈黄白色或黄绿色，各瓶中愈伤组织的数量和质量有明显差异，总的白化现象严重。到30d死亡率达到了100%.

茎段培养一周后，茎段有明显的生长现象，且有新叶长出，培养到20d茎段和茎段上的新叶均出现白化现象，到30d茎段的死亡率为70%.实验结果表明：茎段和叶片在组织培养过程中都会出现白化现象，但叶片的白化现象更为严重。因此选择茎段培养优于叶片培养。

2.2 MS、N6 培养基对波棱瓜雌株分化的影响

将茎段转入N6 培养基和MS培养基中，培养一周后，N6 培养基中的茎段有生长现象，长势一般，培养到20d出现严重白化现象，通过调节光照、温度等方法试图解决，但未得到改善，30d 死亡率达到100%.而在MS 培养基中，茎段有明显的生长现象，且有新叶长出，培养到20d 时，出现白化现象，30d 死亡率达到70%，明显低于在N6 培养基中的茎段。由表1结果表明，MS培养基优于N6培养基。

表1 MS、N6 培养基对波棱瓜雌株分化的影响

2.3 不同配比的蔗糖对波棱瓜雌株的影响

波棱瓜雌株组织培养过程中出现的白化现象，是因为碳源不足引起的。植物缺铁时影响叶绿素的合成，典型的症状是在叶片的叶脉间和细胞网状组织中出现失绿现象，碳源不仅影响植物的生长速度、生长量，还影响其代谢水平，以及细胞的形态和发生。而蔗糖是组织培养中最常用的碳源。本实验通过研究蔗糖不同配比对波棱瓜雌株白化现象的影响。由表2 结果表明,将茎段接种到MS 培养基通过增加蔗糖的含量，随着蔗糖浓度逐步升高在一定范围内叶片与茎段有返青现象，白化现象得到明显的改善。以附加40g／L 蔗糖浓度的培养基为宜，白化率有效降低。

表2 培养基中不同配比的蔗糖对波棱瓜雌株的影响

2.4 不同激素配比对波棱瓜雌株分化芽的影响

从表3 可以看出，含有6-BA 和NAA 两种不同激素在不同浓度配比组合下，随着6-BA 浓度逐步升高在一定范围波棱瓜雌株分化芽有明显增加作用，但6-BA 和NAA 总的激素浓度超过1.5mg／L时，叶片开始出现微微卷曲。而随着NAA 浓度逐步升高在一定范围波棱瓜雌株分化芽有增加作用但不明显，且NAA和6-BA 总的激素浓度超过1.5mg／L 时，叶片生长依然正常，这表明6-BA 起着决定性的作用。分化培养基添加6-BA1.0 mg／L为宜，芽的增殖系数为5.0。

表3 不同激素配比对波棱瓜雌株分化芽的影响

2.5 不同激素配比对波棱瓜雌株生根的影响

切下长1.5～2cm分化芽接种于含有IBA 和IAA 两种不同激素在不同浓度配比组合下的培养基中，由表4 结果表明，在添加IBA1.0mg／L、IAA1.0mg／L 浓度的1/2MS 生根培养基中，生根时间及整齐度为最优。生根率可达到98%左右。

表4 不同激素配比对波棱瓜雌株生根的影响

图1 波棱瓜雌株组织培养分化苗

图2 波棱瓜雌株组织培养生根苗

2.6 试管苗移栽试验

在移栽前，首先进行幼苗筛选将腐烂、发霉、有病虫害及机械损伤的苗子除去。选择健壮、无病虫感染、叶表面光滑，株高10cm左右的优质种苗。

2.6.1 基质选择：基质以田园土、红景天渣、羊粪7：2：1配制基质后装盆待用。

2.6.2 炼苗：将带有3～4 条根的组培苗从三角瓶取出洗净后立即栽入盆中，浇足水，要保持70%的湿度，成活率可达到75%.

2.6.3 田间移栽：炼苗21d 后进行田间移栽。田间移栽时间在5月初到5月下旬进行，天气为阴天，将苗子小心从营养钵中移出，注意不要抖掉土壤，放入小坑内，移栽后及时浇透定根水，加遮阳网缓苗10d左右。

2.6.4 田间管理：移栽后30d进行第一次中耕除草，以后的生长期根据杂草多少随时进行除草。当波棱瓜苗高25cm以上时，需要搭架作业，每2～3行搭架一组，搭架高度2m 以上，以人字形为主。要求搭架材料表面粗糙，易于波棱瓜茎须的攀爬。波棱瓜苗期喜阴凉潮湿的环境，生长期间要注意灌溉保湿，但灌水不可太多，防止引起根的腐烂。移栽后30d 进行第一次除草，以后的生长期根据杂草多少随时进行除草。开花期光照要充足，株间通风要良好。

3 讨论

波棱瓜雌株组织培养实验材料的选取实验表明茎段培养优于叶片培养；基础培养基的选择以MS 为基础培养基为宜；分化培养基以添加6-BA1.0 mg／L为宜，芽的增殖系数可达到5.0；生根培养基以1/2MS+1.0mg／L IBA +1.0mg／L IAA 为宜，生根率达到98%;增加蔗糖的浓度能有效地解决在组培过程中的出现的白化现象.通过组织快繁技术进行波棱瓜雌株的繁殖是提高雌株比例，解决波棱瓜人工栽培中产量低这一瓶颈的有效途径之一。

通过组织快繁技术可以成功的繁殖出波棱瓜雌株苗。通过炼苗、移栽后成活率为50%、株高60cm,开花率为35%、结实率为29%。但在栽培过程中植株长势比野生的弱，株高只有野生的1/2，开花率、结实率均不高。以波棱瓜的生长特性，应在每年的三月底四月初就要开始进行相关栽培工作，分析上述问题可能与移栽时间较晚等原因有关，有待于进一步研究论证。