人工老化对不同含水量西洋参种子生理生化指标的影响

隋昕，邢丽伟，于海娇，于营，鲁海坤，郭靖※

（1.中国农业科学院特产研究所，吉林 长春 130112；2.呼伦贝尔市海拉尔区农牧技术推广中心，内蒙古 呼伦贝尔 021000；3.吉林省知识产权保护中心，吉林 长春 130000）

西洋参（Panax quiquefolium L.）亦称花旗参，为五加科人参属植物，以根入药，性凉，味微苦，有补气养阴、清热生津的功效，具有较高的药用价值[1]。西洋参原产地为美国及加拿大，我国于20世纪70年代引种成功，并发展成为西洋参主产国。种子是西洋参的繁殖材料和遗传载体，在其种质保存和播种之前都需要一定的贮藏过程。种子贮藏过程中的老化是不可逆的，贮藏期间种子活力下降，种子内部发生复杂的生理生化变化。种子含水量是影响种子贮藏寿命的主要因素之一，因此研究贮藏过程中不同含水量西洋参种子的生理生化变化，可明确种子贮藏的适宜含水量，揭示西洋参种子的老化机制，对西洋参生产和种质资源的保存具有重要意义。

大量研究证明，采用人工老化处理的种子与自然老化的种子生理生化变化并无明显差异[2-4]。因此，可通过对种子人工老化模拟自然贮藏时种子的生理生化变化[5]。本实验采用高温（48℃±0.5℃）加速种子老化，研究不同含水量的西洋参种子的生理生化变化规律，为西洋参种子的种质保存和常规贮藏提供理论和技术参考。

1 材料与方法

1.1 材料及处理

1.1.1 试验材料 试验所用西洋参种子采购于吉林省通化县富强镇富裕村，千粒重为36.73 g。

1.1.2 不同含水量种子制备 参照国家《农作物种检验规程水分测定》（GB/T 3543.6-1995）测定西洋参种子含水量。测得初始含水量为5.43%，参考夏方山等[6]的方法进行处理，分别获得含水量为3.27%、8.44%的种子，将含水量分别为3.27%、5.43%和8.44%的西洋参种子装入铝箔袋中密封保存备用。

1.2 实验方法

1.2.1 种子的人工老化 参考夏方山等的方法进行种子老化，略有改动[6]。将含水量分别为3.27%、5.43%和8.44%的西洋参种子每150 g为一袋密封于锡纸袋中，置于恒温水浴锅中（48℃±0.5℃）进行老化，分别在0d、5d、10d、15d 取出种子，待种子温度降至室温后于 20℃冰箱保存。

1.2.2 发芽指标的测定 将西洋参种子和沙子消毒后按1:3 比例搅拌均匀，然后置于恒温箱中，19 ℃± 1 ℃下层积处理120 d 左右，每7 d 翻倒一次种子，沙子含水量保持在20%左右，待西洋参种子裂口后参照李红钰等[7]的方法进行发芽试验，在7 d 时统计种子发芽势，14 d 时统计种子发芽率。

1.2.3 生理生化指标的测定 可溶性糖含量采用苯酚 硫酸法进行测定[8]。相对电导率参照姚侠妹等[9]的方法进行测定。丙二醛（MDA）含量采用2-硫代巴比妥酸法进行测定[10]。超氧阴离子（O2-）产生速率使用Solarbio 公司提供的超氧阴离子含量检测试剂盒进行测定。超氧化物歧化酶（SOD）活性采用氮蓝四唑（NBT）光还原法进行测定[10]。过氧化氢酶（CAT）活性采用紫外吸收法进行测定[10]。

1.3 数据分析

试验数据采用SPSS 13.0 软件进行多重比较及方差分析，使用Excel 2016 进行数据统计、计算及作图。

2 结果与分析

2.1 人工老化对西洋参种子发芽指标的影响

由图1可知，不同含水量（3.27%、5.43%和8.44%，下同）的西洋参种子随着老化时间的延长，其发芽率及发芽势均呈现下降趋势，且含水量低的种子发芽率及发芽势下降幅度小。在老化0d时，不同含水量的西洋参种子发芽率为81%左右，发芽势为70%左右。老化5 d后，含水量3.27%和8.44%的种子差异显著（P＜0.05），二者发芽率相差6.13%，发芽势相差3.33%。老化10 d后，含水量3.27%和5.43%的种子发芽率虽无明显差异（P＞0.05），但发芽势呈显著差异（P＜0.05），说明含水量3.27%的种子活力要优于含水量5.43%的种子。在老化15 d 后，不同含水量种子的发芽率及发芽势差异显著（P＜0.05），发芽率分别下降了30.44%、34.95%和40.01%，发芽势分别下降了28%、34%和38%。

图1 人工老化对不同含水量西洋参种子发芽率和发芽势的影响Fig.1 Effects of artificial aging on the germination rate and germination potential of American ginseng seeds with the different water content

2.2 人工老化对西洋参种子可溶性糖含量的影响

由图2（a）可知，随着老化时间的延长，含水量3.27%和5.43%的西洋参种子可溶性糖含量呈下降趋势；含水量8.44%的种子可溶性糖含量呈先下降后上升的趋势，且在老化10 d 时下降幅度最大。老化0 d、5 d时，含水量3.27%和8.44%的西洋参种子可溶性糖含量差异显著（P＜0.05）。老化10 d后，含水量3.27%和5.43%的种子可溶性糖含量差异显著（P＜0.05）；含水量8.44%的种子可溶性糖含量为91.33 mg/g，较老化前下降了14.99 mg/g。老化15 d后，含水量3.27%和5.43%的种子可溶性糖含量分别下降了14.68 mg/g和19.81 mg/g；含水量8.44%的种子可溶性糖含量较老化10 d 时上升了4.4 mg/g。

图2 人工老化对不同含水量西洋参种子可溶性糖含量和相对电导率的影响Fig.2 Effects of artificial aging on soluble sugar content and relative conductivity of American ginseng seeds with different water content

2.3 人工老化对西洋参种子相对电导率的影响

由图2（b）可知，不同含水量的西洋参种子随着老化时间延长，其相对电导率呈上升趋势，且种子含水量越高，上升幅度越大。在老化0 d 时，不同含水量种子的相对电导率在50%左右。老化5 d后，含水量3.27%和8.44%的种子之间差异显著（P＜0.05），二者差距为2.47%。老化10 d 后，不同含水量种子相对电导率差异显著（P＜0.05）。在老化15 d 后，含水量8.44%的种子相对电导率上升幅度最大，不同含水量种子相对电导率分别上升了19.07%、23.92%和27.32%。

2.4 人工老化对西洋参种子MDA含量的影响

由图3（a）可知，随着老化时间的延长，不同含水量的西洋参种子MDA 含量均呈上升趋势，且MDA含量随种子含水量的升高而增大。在老化0 d时，不同含水量的西洋参种子MDA含量无显著差异（P＞0.05）。老化5 d 后，含水量3.27%的种子与含水量5.43%和8.44%的种子MDA 含量有显著差异（P＜0.05），且含量相对较低，分别相差0.93、1.54mol/g。老化10 d后，不同含水量的种子之间的差异越来越显著（P＜0.05）。老化15 d 后，含水量3.27%的种子MDA 含量最低，含水量8.44%的种子MDA 含量最高，二者相差5.53mol/g。不同含水量的种子MDA 含量分别上升了5.94mol/g、8.53mol/g 和11.32mol/g。

图3 人工老化对不同含水量西洋参种子MDA 含量和O2-产生速率的影响Fig.3 Effects of artificial aging on MDA content and O2-production rate in American ginseng seeds with different water content

2.5 人工老化对西洋参种子超氧阴离子产生速率的影响

由图3（b）可知，在老化0 d 时，不同含水量西洋参种子之间O2-产生速率无显著差异（P＞0.05）。在老化5 d 后，含水量3.27%和5.43%的种子差异不显著（P＞0.05），但含水量8.44%的种子与二者差异显著（P＜0.05），其O2-产生速率上升幅度较大。在老化10 d 后，不同含水量的种子O2-产生速率差异显著（P＜0.05）。在老化15 d 后，含水量8.44%的种子O2-产生速率最高，含水量3.27%的种子O2-产生速率最低，二者相差12.43 nmol/（min g）。随着老化时间的延长，不同含水量的西洋参种子O2-产生速率均呈上升趋势，且O2-产生速率积累速率逐渐加快。种子含水量越高，O2-产生速率上升幅度越大，不同含水量种子分别上升了17.98 nmol/（min g）、23.97 nmol/（min g）和30.32 nmol/（min g）。

2.6 人工老化对西洋参种子抗氧化酶的影响

由图4（a）可知，不同含水量的西洋参种子SOD活性在老化过程中都呈现出下降趋势。至老化完成时，不同含水量的种子SOD 活性分别下降了52.68 U/g、60.46 U/g 和72.01 U/g。在老化0 d 时不同含水量的种子SOD活性差异不显著（P＞0.05）。在老化5d 后，含水量3.27%和8.44%的种子之间有显著差异（P＜0.05），二者相差10.96 U/g。在老化10 d 后，含水量3.27%和5.43%的种子之间无显著差异（P＞0.05），二者与含水量8.44%的种子差异显著（P＜0.05）。在老化15d 后，不同含水量的种子SOD 活性差异显著（P＜0.05），含水量高的种子SOD 活性相对较低，含水量8.44%的种子SOD 活性最低，为159.16 U/g。

图4 人工老化对不同含水量西洋参种子抗氧化酶活性的影响Fig.4 Effects of artificial aging on the activities of antioxidant enzymes of American ginseng seeds with different water content

由图4（b）可知，随着老化时间的延长，不同含水量的西洋参种子CAT 活性呈下降趋势，且下降速度逐渐加快。在老化0 d时，不同含水量的种子无显著差异（P＞0.05）。在老化5 d 后，含水量8.44%的种子较其他含水量种子CAT 活性下降更显著（P＜0.05）。在老化10 d 后，含水量5.43%和8.44%的种子之间无显著差异（P＞0.05），但二者CAT 活性低于含水量3.27%的种子。在老化15 d后，不同含水量的种子之间CAT 活性差异显著（P＜0.05），且含水量8.44%的种子CAT 活性最低。不同含水量种子的CAT 活性分别下降了203.87 U/g、262.48 U/g 和287.96 U/g，可见含水量高的种子随老化时间的延长下降幅度相对较小，含水量3.27%的种子CAT 活性下降最小。

3 讨论与结论

研究表明，含水量对种子贮藏期间的寿命有直接影响，种子含水量在5%～14%时，每升高1%，种子的寿命就缩短一倍[11]。种子的老化是一个复杂且逐渐变化的过程，伴随着许多生理生化反应，种子的发芽率和发芽势可以直观地表现出种子的活力水平及萌发能力。本实验西洋参种子发芽率及发芽势的测定结果表明，在种子老化过程中，发芽率和发芽指数随含水量的增加而降低。在老化15 d 后，含水量3.27%的西洋参种子发芽率及发芽势最高，分别为50.77%和41.78%；含水量8.44%的种子发芽率及发芽势最低，分别为41.33%和32%。鲁海坤等[12]在研究不同含水量蒙古黄芪种子人工老化的变化时发现相同规律。

可溶性糖作为种子重要的贮藏物质之一，是种子呼吸作用的主要底物，为种子的生命活动提供能量。在本实验中含水量3.27%和5.43%的西洋参种子可溶性糖含量呈下降趋势，与菠菜、毛竹及芥蓝等种子人工老化后可溶性糖含量变化趋势一致，这是种子在高温条件下呼吸作用增强、糖消耗加快导致[13-15]。含水量8.44%的种子可溶性糖含量呈先下降后上升的趋势，与小麦、大豆等种子人工老化后可溶性糖含量变化相似，这是高温下种子细胞膜遭到破坏，导致可溶性糖渗出[16-18]。

膜脂过氧化是种子老化的主要变化之一，种子在氧化酶或自身氧化下产生的自由基会攻击细胞内的脂类物质，破坏细胞膜的完整性，促使种子老化加剧[19]。MDA 是膜脂过氧化反应的产物之一，具有很强的毒性，会破坏细胞膜结构。膜脂过氧化的程度与MDA含量呈正相关。不同含水量的西洋参种子在老化后MDA含量均呈上升趋势，且含水量低的种子上升幅度较小，说明低含水量的种子在老化后膜脂过氧化程度低于高含水量种子，其中含水量3.27%的种子MDA 含量累积最少，所受毒害最轻。在膜脂过氧化后，细胞膜结构破坏，细胞膜通透性逐渐增大，细胞内物质逐渐渗出，相对电导率也随之增大。西洋参种子在老化后相对电导率均呈上升趋势，其中含水量3.27%的种子上升幅度最小，含水量8.44%的种子上升幅度最大，说明细胞膜损伤程度随着种子含水量的增加而逐渐严重，这与吴聚兰等[20]对大豆种子老化的研究结果相似。

活性氧（ROS）是氧的代谢产物，具有很高的化学反应活性，会诱导脂膜发生过氧化反应，是破坏膜完整性的主要因素之一[21]。O2-是种子内主要的ROS 之一，由氧原子携带2 个电子形成，具有很强的还原性和氧化性，性质活泼，其累积过多会对种子造成不可逆的损伤。唐嘉等[22]在老芒麦种子老化的研究中发现种胚中O2-产生速率逐渐提高，O2-的积累是种子氧化损伤的主要原因之一。在本研究中西洋参种子O2-产生速率随着老化时间的延长而逐渐提高，其中含水量高的种子O2-产生速率上升幅度更大，因含水量高的种子积累较多的O2-，导致膜结构损伤更严重，这也是其相对电导率较高的原因之一。

正常的生理状态下，种子通过抗氧化剂和抗氧化酶系统两种方式清除ROS，防止其破坏种子结构，ROS的产生和清除处于动态平衡的状态。O2-在SOD 的作用下发生歧化反应产生H2O2和O2，这是种子清除ROS 的第一道防线。CAT 可专一清除H2O2，是种子保持抗氧化和氧化平衡的关键酶，具有加强的催化能力。有研究表明O2-和H2O2会与CAT 反应生成复合物，降低CAT 的氧化能力[23]。孙春青等在研究结球甘蓝种子的老化过程中SOD 和CAT 等抗氧化酶活性下降，糯玉米、烟草等植物的种子在老化后SOD、CAT等抗氧化酶的变化也呈相同趋势[24-26]。在西洋参种子的老化过程中，SOD 和CAT 活力下降，且含水量越高的种子SOD 和CAT 活性下降越快。种子SOD 活性下降，无法及时清除O2-，O2-产生速率加快，积累量逐渐增多。而O2-的积累会进一步降低CAT 的氧化能力，最终导致种子的结构因氧化而遭到严重破坏。

随着老化时间的延长，与高含水量的西洋参种子相比，低含水量的种子发芽率及发芽势下降幅度小，SOD、CAT 等抗氧化酶活性下降少，MDA 和O2-等有毒物质积累较少，细胞膜受损程度较轻。含水量低的西洋参种子抗氧化能力相对较强，更能抵御不良环境的刺激，更适宜贮藏，即含水量3.27%的西洋参种子更适宜贮藏。