基于网络药理学探究温阳通淋汤对于肾盂肾炎的炎症抵抗机制

王碧岩，步洪石，刘战，姜祥雨，周凯旋，童延清

（1.长春中医药大学，吉林 长春 130117；2.长春中医药大学附属医院，吉林 长春 130021）

肾盂肾炎（pyelonephritis）是最常见的肾脏病之一，常由细菌感染所引起，根据病程可分为急性肾盂肾炎和慢性肾盂肾炎。其主要表现为肾盂和肾盏存在慢性炎症，肾盂扩大并畸形，且肾皮质及乳头部有瘢痕形成，肾髓质变形，肾盂、肾盏黏膜及输尿管管壁增厚，严重者肾实质广泛萎缩，且肾盂肾炎慢性期患者容易出现肾功能不全[1]。肾盂肾炎是尿路感染常见的一种临床类型。目前，经研究表明女性发生尿路感染的机率大于男性，比例为8:1[2]，此外，已婚女性发病率高于未婚，与性生活、月经和妊娠等有关[3]。中医认为，肾盂肾炎属于“淋证”、“水肿”、“腰痛”、“虚劳”和“尿血”等范畴，主要因肺、脾、肾三脏虚损所引起，以风、寒、湿热、疮毒和瘀血等为标实，是造成患者症状加重和恶化的主要因素[4,5]。大量的临床研究证实，中医中药抵抗肾盂肾炎的炎症反应具有一定优势，既能改善症状体征、提高临床治愈率，又能在提升患者的抵抗力、降低疾病的发生率方面发挥关键作用。温阳通淋汤是童延清教授治疗尿路感染的经验方，由通草、滑石、赤芍、茴香、官桂、荔枝核、天葵子、瞿麦和马齿苋组成，经临床应用以及动物实验研究表明，温阳通淋汤对于上行性尿路感染可以起到预防作用，对于相关炎症因子的控制具有良好效果[6,7]。

目前，中药网络药理学通过对中药成分、疾病和药物多成分协同作用的大规模筛选，广泛应用于中药多成分协作、中药方剂的配伍规律和网络调节机理分析等[8,9]。研究基于网络药理学和分子对接技术，构建温阳通淋汤抵抗肾盂肾炎炎症反应的作用机制网络，研究其化学成分、可能的作用靶点以及相关信号通路，为其临床应用和实验研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 数据库及软件

中药系统药理学分析平台TCMSP（http://tcmspw.com/）；PubChem数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）；SwissTargetPrediction数据库（http://www.swisstargetprediction.ch/）；GeneCards 数据库（https://www.genecards.org/）；OMIM 数据库：（https://omim.org/）；DisGeNET数据库（https://www.disgenet.org/）；STRING数据库（https://string-db.org/）；DAVID数据库：（https://david.ncifcrf.gov/）；微生信在线绘图云平台（http://www.bioinformatics.com.cn/）；Cytoscape 3.5.0软件；Uniprot数据库：（https://www.uniprot.org/）；SYBYL-X 2.0软件，以上数据库使用时间截止至2021年12月。

1.2 药物化学成分及潜在靶点搜集

在TCMSP 数据库中分别以滑石、赤芍、茴香、官桂、荔枝核、天葵子、瞿麦和马齿苋为关键词进行检索，口服生物利用度（Oral Bioavailability,OB）和类药性（DrugLikeness,DL）是评价一个化合物是否可以发展成为一个药物的重要指标[10,11]，依照OB%≥30，DL≥0.18的条件，检索筛选温阳通淋汤中符合上述的化学成分。Swiss Target Prediction 数据库可基于已知配体2D 和3D结构准确预测活性分子的靶点[12]。本研究通过Pub-Chem 数据库下载化学成分结构的SDF 格式文件，然后结合Swiss Target Prediction 数据库检索化学成分所对应的相关靶点。

1.3 肾盂肾炎潜在靶点搜集

通过GeneCards 数据库、OMIM 数据库以及DisGeNET数据库，以“pyelonephritis”为关键词检索收集肾盂肾炎相关靶点。

1.4 “中药-化学成分-靶点-疾病”网络构建

分别录入温阳通淋汤与肾盂肾炎的靶点到Venny 2.1 在线软件作图工具平台，将二者比较后取交集，并绘制韦恩图，得到药物与疾病的共有靶点。将中药，成分，共有靶点，疾病的相关数据导入Cytoscape 3.5.0 软件，构建中药 化学成分 靶点 疾病网络。

1.5 蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络构建及核心靶点筛选

将“1.4”项中筛选得到的温阳通淋汤抵抗肾盂肾炎炎症反应交集靶点信息导入STRING 数据库，限定物种为“Homo sapiens”，以最小置信度（minimum required interaction score）＞0.4 为筛选条件，下载交集靶点的PPI 网络的TSV 文件。将下载文件导入Cytoscape3.5.0 软件构建PPI 网络，进而筛选核心靶点。

1.6 GO和KEGG通路富集分析

为深入了解上述筛选出的温阳通淋汤抵抗肾盂肾炎炎症反应的潜在作用靶点基因的功能以及在信号通路中的作用，运用DAVID 数据库进行GO（Gene Ontology）和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）通路富集分析，以P＜0.04 为筛选条件，限定物种为“Homo sapiens”。按照其富集的靶点数目进行排序，选取KEGG 通路前20 个条目进行可视化。并使用微生信在线绘图云平台绘制高级气泡图，将结果可视化。

1.7 温阳通淋汤的“中药-靶点-通路”网络构建

通过结合文献分析KEGG 通路富集数据，选取通过调控炎症因子表达或炎症反应可能治疗肾盂肾炎的相关通路。将相关数据导入Cytoscape3.5.0 软件构建中药-靶点-通路网络。通过分析中药-靶点-通路网络，进一步阐述温阳通淋汤抵抗肾盂肾炎炎症反应的潜在作用机制。

1.8 核心化合物-核心靶点分子对接

从Uniprot数据库下载“1.5”项中筛选得到的核心靶点的3D 晶体结构，并从TCMSP 数据库下载“1.7”项中得出的degree 值排名前10 的核心化合物的3D晶体结构，首先使用SYBYL-X 2.0 软件进行“去水”预处理，然后将核心化合物与核心靶点进行分子对接，以Total Score大小作为化合物与靶点结合能力强弱的判别依据，最后对分子对接结果进行绘图。

2 结果

2.1 温阳通淋汤药物化学成分及潜在靶点信息

通过TCMSP数据库得到温阳通淋汤中化合物共58 个，其中25 个来自赤芍、1个来自茴香、3 个来自荔枝核、8 个来自马齿苋、2 个来自瞿麦、4 个来自肉桂、7 个来自天葵子、3 个来自通草，且MOL000449 来自于赤芍、茴香和荔枝核，MOL000358 来自于赤芍、茴香、荔枝核和马齿苋，MOL002883来自于赤芍和荔枝核，MOL000359 来自于赤芍、通草、荔枝核，MOL000098来自于荔枝核、马齿苋。根据OB≥30%同时DL≥0.18的标准进行筛选，其中肉桂不满足相关筛选条件，所以以OB≥30%、DL≥0.12 的标准进行筛选。

2.2 疾病潜在靶点

在GeneCards 数据库、OMIM 数据库以及DisGe-NET数据库分别获取到疾病相关靶点544 个、112 个、71 个，去重筛选后最终获得了669 个肾盂肾炎疾病相关靶点。

2.3 “药物-化合物-疾病-靶点”网络分析

利用微生信在线作图云平台，将“2.1”项中筛选得到的温阳通淋汤组方中所有潜在靶点与“2.2”项中有关的疾病669 个靶点输入，制作Venn 图，如图1所示，最终得到92 个交集靶点，表明温阳通淋汤可能通过该92 个潜在靶点对肾盂肾炎发挥炎症抵抗作用。92 个交集靶点相关的化学成分中，赤芍（Red peony）包含29 个、茴香（Anise）3 个、荔枝核（Litchi Semen）8个、马齿苋（MA-CHMINACA）10 个、瞿麦（Dianthi Herba）2 个、肉桂（Cinnanmomi Cortex）4 个、天葵子（Semiaquilegiae Radix）7 个、通草（Tetrapanax papyriferus）4个。化学成分信息见表1。采用Cytoscape 3.5.0 软件构建温阳通淋汤组方的“中药 化学成分 靶点 疾病”网络图见图2。该网络图共有160 个节点和728 条边，160 个节点中包含8 个中药名称，58 个化学成分，92个交集靶点，以疾病名称为中心，第1 圈层为中药名称，第2、3 圈层为药物成分，第4、5 圈层为疾病靶点。该网络图体现了中药多成分多靶点的特点，从化合物角度分析，按照度值（Degree）对网络进行拓扑学分析，其中有9 个化学成分拥有超过15 个作用靶点，包括MOL001918、MOL011356、MOL007016、MOL007005、MOL011363、MOL007004、MOL001921、MOL008006和MOL000057，分别能与18、18、18、18、18、15、15、15和15 个活性化合物相互作用。

图1 疾病肾盂肾炎 复方温阳通淋汤的Venn 图Fig.1 Venn diagram of disease pyelonephritis compound Wenyang Tonglin Decoction

图2 “中药 化学成分 靶点 疾病”网络图Fig.2 Network diagram of“Traditional Chinese Medicine chemical composition target disease“

表1 复方温阳通淋汤活性成分Table 1 Active ingredients of compound Wenyang Tonglin Decoction

续表

2.4 PPI网络分析及核心靶点筛选

通过Cytoscape3.5.0 软件构建PPI 网络，见图3。该网络包含90 个节点和784 条边。靶点蛋白的平均节点度值（degree值）为29，其中大于平均度值靶点共有16 个，此16 个靶点可能是温阳通淋汤抵抗肾盂肾炎炎症反应的关键靶点。根据度值降序排序，并按照degree 值的中位数的2 倍值进行筛选，然后分别按照CLOSENESS、BETWENESS值降序排序，并按照中位数值分别进行筛选，获得6 个核心靶点基因主要包括TNF（degree值为57）、ALB（degree值为56）、GAPDH（degree 值为54）、IL6（degree 值为52）、表皮生长因子（EGFR,Epidermal growth factor receptor，degree 值为49）和VEGFA（degree 值为49）。分别能与5、9、2、3、17、13 个活性化合物相互作用。

图3 疾病肾盂肾炎 复方温阳通淋汤的PPI 网络图Fig.3 PPI network diagram of disease pyelonephritis compound Wenyang Tonglin Decoction

2.5 GO和KEGG通路富集分析及“中药-靶点-通路”网络的构建

通过DAVID 数据库对交集靶点进行GO 生物过程（GO biological processes,GO-BP）、GO 细胞组成（GO Cellular Components,GO-CC）和GO 分子功能（GO Molecular Functions,GO-MF）富集分析，以P＜0.04 筛选标准，GO-BP 条目243 条，主要涉及调控细胞增殖、炎症反应以及免疫应答等；GO-CC 条目38条，主要涉及质膜，质膜外侧和受体复合物等；GO-MF条目58 条，主要涉及细胞因子活性、蛋白酶活性和蛋白质结合等。以上数据按-lg P 值转换的P-value 值排序，分别选取富集程度前10 条，绘制高级气泡图（图4）。另外，KEGG 富集分析得到94 条（P＜0.04）信号通路，选取其富集程度前20 条绘制柱状图（图5）。KEGG前20 条通路主要涉及糖尿病并发症中的TNF信号（hsa04668:TNF signaling pathway）、PI3K-AKT 信号（hsa04151：PI3K-Akt signaling pathway）、HIF-1 信号（hsa04066：HIF-1 signaling pathway）等。中药-靶点-通路网络如图6所示。通过对温阳通淋汤配伍的“中药-靶点-通路”进行网络分析，筛选degree 值排名前10 的为核心化合物，其中8 个来自于赤芍，分别是MOL007018（9-ethyl-neo-paeoniaflorin A）、MOL002714（黄芩素，baicalein）、MOL001921（芍药新苷，Lactiflorin）、MOL001002（鞣花酸，ellagic acid）、MOL007014（8-debenzoylpaeonidanin）、MOL007005（芍药内酯苷，Albiflorin）、MOL007003（benzoyl paeoniflorin）、MOL001925（芍药苷，paeoniflorin）；2 个来自于天葵子分别是：MOL011363[4-（beta-D-glucosyloxy）benzoic acid]、MOL002894（小檗红碱，berberrubine）。以此可以预测温阳通淋汤在抵抗肾盂肾炎炎症反应的机制中，赤芍、天葵子可能起到主要的治疗作用。

图4 GO 功能富集分析分析柱状图Fig.4 Histogram of GO function enrichment analysis

图5 KEGG 信号通路分析气泡图Fig.5 Bubble diagram of KEGG signal path analysis

图6 中药-靶点-通路网络Fig.6 Traditional Chinese medicine target pathway network

2.6 核心化合物-核心靶点分子对接结果

分子对接亲和力结果如表2所示。采用SYBYLX 2.0 软件对6 个关键靶点与10 个活性成分进行分子对接验证。靶点-化合物结合得分（Total Score）从大到小排列为：EGFR 与MOL007003（8.088 2）、ALB 与MOL007003（7.396 7）、ALB与MOL001921（7.257 3）、GAPDH与MOL001925（6.2276）、GAPDH与MOL007014（6.209 8）、GAPDH 与MOL007003（6.116 4）、ALB 与MOL007018（6.036 7）、ALB与MOL001925（5.997 2）、EGFR 与MOL001921（5.997 2）、ALB 与MOL002894（5.824 1），一般认为，配体与受体Total Score 越高，结合的构象越稳定，因此认为核心化合物与核心靶点具有较强的结合力，利用SYBYL 软件对上述靶点与化合物对接进行可视化处理，见图7。

图7 核心化合物-核心靶点分子对接图Fig.7 Core compounds core targets molecular docking diagram

表2 分子对接结果Table 2 Molecular docking results

续表

3 讨论

肾盂肾炎是菌尿由膀胱起始，从输尿管上升到肾脏引起的肾实质炎症，炎性细胞因子等在感染过程中发挥着关键的警示与促进疾病发展的作用，因此在针对肾盂肾炎进行治疗时，除考虑必要的抗菌效果外，缓解炎症损伤同样是值得注意的关键节点。研究通过网络药理学与分子对接的方法，针对肾盂肾炎经典诊疗方剂的抗炎效果进行机制分析，对于完善肾盂肾炎的诊疗方案与病理机制的研究具有明确的参考价值。

研究表明，肾盂肾炎等肾脏疾病的发生和发展涉及复杂的机制，其中炎症和氧化应激被认为是两个主要因素。人们普遍认为，在某些肾脏疾病的初始阶段存在与肾功能不全相关的轻度炎症[13,14]。随着肾炎的进展，炎症的扩大和持续，肿瘤坏死因子-（TNF- ）和白细胞介素-6（IL-6）将持续升高[15]。IL-6 持续合成异常与慢性炎症的发生有着密切联系，IL-6 是多效性炎性细胞因子，由单核细胞以及巨噬细胞产生，是炎性介质网络的关键成分，参与炎症反应过程，它不仅对血管内皮细胞及炎症细胞具有直接的激活和毒性作用，还会诱导急性期蛋白的合成、催化和放大炎症反应及毒性作用，造成组织细胞损害。有研究表明[16]，收集患有急性肾盂肾炎或无症状菌尿的女性患者在治疗前后采集的尿液和血清样本时发现，无论感染的严重程度如何，大多数细菌感染的尿液样本中IL-6 活性均升高。研究表明，在由LPS 和TNF 激活的多种信号传递机制中，多种NF- B激活通路在引发炎症过程的基因诱导（催生变异）中起到了尤为重要的作用，而NF- B（炎症反应中重要的转录因子）的不正确调节与癌症、炎症等有关。血管内皮生长因子A（vascular endothelial growth factor,VEGFA）在血管生成和内皮细胞生长中具有活性，诱导内皮细胞增殖，促进细胞迁移，抑制细胞凋亡并诱导增加血管通透性。研究表明血管内皮生长因子可以通过自身的磷酸化激活，而IL-6 可以诱导VEGF的过度生成导致血管生成增强和血管通透性增加，这是炎症病变的病理特征[17]。ALB又名阴性急性反应蛋白，与炎症反应的程度成反比。

通过对核心化学成分的分析中发现，芍药苷（Pae）是芍药的主要活性成分，其具有广泛的抗炎和免疫调节作用[18]。Pae在实验性关节炎、银屑病和自身免疫性脑脊髓炎等自身免疫性疾病动物模型的体内发挥着抑制炎症的作用，具体的机制可能是Pae 可以调节免疫细胞的功能、激活相关免疫细胞和减少炎症介质的产生。Pae 通过抑制异常活化的细胞亚群来平衡免疫细胞亚群。Pae 可通过调控多种信号通路（GPCR 通路、MAPKs/NF- B 通路、PI3K/Akt/mTOR 通路、JAK2/STAT3 通路和TGF /Smads等）发挥抗炎作用。LPS诱导RAW264.7 巨噬细胞产生TNF- 和IL-6 等细胞因子，芍药内酯苷和Pae 有阻碍TNF- 和IL-6 基因表达的药理作用，二者可能抑制LPS 诱导的iNOS 和COX-2 基因表达以及随后NO 和PGE2 的产生和COX-2 蛋白的表达[19]。鞣花酸[20]是存在于各种水果和蔬菜中的一种天然的抗酚类抗氧化剂，可以通过抑制PI3K/Akt 的激活，减少炎症介质包括TNF-、IL-6和干扰素- ，从而实现炎症抵抗，改善疾病的严重程度。黄芩素[21]是一种具有生物活性的黄酮类化合物，被广泛用于抗炎、抗菌、抗病毒、抗氧化和抗肿瘤等治疗方向[22,23]，具有显著的临床效果。

信号转导和转录激活因子（STAT）被janus 激酶（JAK）磷酸化、二聚化，然后通过核膜转运到细胞核中，调节相关基因的表达，这种途径被称为janus激酶信号转导和转录激活（JAK/STAT）信号途径，也称为IL-6 信号转导通路，是近年来发现的一种细胞因子刺激的信号转导通路。该信号通路可调节多种生物过程，包括细胞存活、细胞增殖和细胞周期等。此外，它在细胞凋亡和炎症中起着关键作用[24]，各种细胞因子和生长因子通过JAK/STAT 信号通路传递信号，包括白细胞介素2～7（IL-2～7）、表皮生长因子（EGF）等[25]。JAK2/STAT3 信号通路已被证明在LPS 刺激的RAW264.7细胞中开启并释放炎症细胞因子，如IL-1、TNF- 和IL-6 等[26]。有学者运用脂联素灭活JAK2/STAT3 信号通路可以缓解肾盂肾炎模型小鼠的肾细胞凋亡情况以及炎症反应[27]。

此外，炎症和氧化应激是相互诱导、相互促进的，一般会逐渐形成炎性反应与氧化应激反应的恶性循环[28]。例如，NF- B 的活性直接被活性氧（ROS）增强[29,30]。反之，NF- B 通过调控gp91phox12 诱导ROS 的产生。一些证据表明，在肾盂肾炎的早期阶段，甚至在炎症开始之前，ROS 水平上调，抗氧化系统的能力被严重破坏[31,32]。PI3K 和下游效应因子Akt 属于一个保守的信号转导酶家族，参与调节细胞活化、炎症反应和凋亡。而PI3K/Akt 信号通路参与了促炎基因刺激NF- B活性的调控[33]。

综上所述，本研究基于网络药理学对温阳通淋汤配伍的多成分、多靶点、多通路与肾盂肾炎的复杂网络关系进行研究，初步阐述了温阳通淋汤配伍抵抗肾盂肾炎炎症反应的主要潜在药效成分、作用靶点以及相关通路，可通过PI3K/Akt 等信号通路，调控炎症反应和炎症因子等发挥抵抗肾盂肾炎炎症反应的作用。本研究可为温阳通淋汤临床应用和实验研究提供理论依据，也为后续研究中药复方对于肾盂肾炎的疗效提供思路和参考。